荧光定量PCR检测HCV RNA不同核酸提取法的应用对比

高洁 严敏 付婷 邵中军

丙型肝炎是临床工作中比较常见的一类传染病，该病主要是由丙型肝炎病毒感染通过人体的免疫途径引起正常肝脏细胞的破坏导致的[1]。丙肝可以通过血液以及体液等多种方式在人群中间传播，临床症状有发热、恶心、呕吐等。该病如果不及时治疗，易进展为肝硬化甚至导致患者罹患肝癌[2]，因此，如何对丙肝进行科学准确的诊断成为临床研究的重点与热点。根据现有的技术与研究，目前主要通过检测致病病毒（HCV）RNA的含量进行丙肝的特异性检测。该方法科学准确，能够很好的诊断丙型肝炎。提取病毒的RNA有多重方式可以选择，出于经济以及可行性等多方面的综合考虑，临床主要采取氯仿—异丙醇法以及核酸分离柱两种方法对丙型肝炎病毒的RNA进行提取[3]。为了研究两种提取方法临床价值的差异，为临床工作提供选择依据，本研究利用治疗的110例患者的样本采用荧光定量PCR的方法对两种提取RNA的方法进行检测，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在2016年9月—2017年9月乙肝防治示范区医院门诊诊断的患有丙型肝炎患者的血清样本110份进行观察研究。所有提供血清的患者年龄19～63岁，平均年龄（32.12±2.10）岁，按照随机化的原则把这些血清样本分为实验组和对照组，保证两组样本数相同。其中实验组样本数55份，样本提供者女性有20例，男性35例，提供者年龄26～68岁，平均年龄（44.42±3.18）岁；对照组样本数55份，样本提供者女性有23例，男性32例，提供者年龄27～67岁，平均年龄（45.33±2.97）岁，两组样本间对比，差异无统计学意义，P＞0.05，可比较。

1.2 仪器与试剂

本次研究使用的荧光定量PCR仪器使用的是美国AB公司的ABI 7500 FAST分析仪。两种不用的提取方法使用的试剂（提取剂、扩增剂）全都购买于天根生化科技(北京)有限公司，生化试剂采购自Sigma-Aldrich中国公司。

1.3 RNA的提取方法

（1）实验组血清样本采用核酸分离柱的方法进行RNA的提取。①离心管内放入RNA酶的抑制剂，防止RNA被分解[4]。抑制剂的用量选择20 μl，在同一离心管内加入血清标本和标准品，同时放入用于帮助RNA凝结沉淀的裂解液，该溶剂用量为100 μl，轻柔地把以上溶剂混匀[5]，然后进行加热处理，时间为10分钟，加热温度选择70℃，对加热过的溶剂离心，时间5～6秒。将无水乙醇放入离心管内，同样轻柔地摇晃混匀，乙醇用量为110 μl；②以上操作完成后，把离心管内物质转移入提取柱中，使用装置的负压功能将液体和沉淀分开，去除液体。然后使用A和B洗涤液对沉淀进行洗涤，洗涤液用量采用500 μl；③操作完成后把提取柱取出，放入离心管中，转速选择14 000转，离心1分钟。离心完成后再次将其置入新的离心管，向其中加入洗脱液，量为50 μl，加样的时候注意应置于膜的中央位置，安静放置1分钟后，用10 000转的速度进行离心，再次加入洗脱液12.5 μl，接着按照荧光定量PCR的操作步骤进行RNA的检测，分析本方法提取RNA的效率以及重复性。（2）对照组样本选择氯仿-异丙醇的方法对RNA进行提取。①离心管内放入裂解液，该溶剂用量为100 μl，在同一离心管内加入血清标本和标准品，轻柔地用灭过菌的吸头把以上溶剂混匀，向其中加入氯仿50 μl，混匀离心。②在另一个干净的离心管中加入异丙醇，加入上一步离心产生的上清液，混匀后用13 000 r/min的速度进行离心，时间为15分钟。弃上清后再次离心，加入DEPC后选择2 000转的速度离心5分钟，之后采用PCR进行提取结果的检测。

1.4 观察指标

检测两种提取方法提取RNA的效率以及重复性。

1.5 统计学方法

数据用SPSS19.0统计学软件进行处理，计量资料用（x-±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组间样本提取效率的比较

用PCR方法检测两组提取RNA的效率（HCV RNA浓度高于1.0×103copies/ml可以检测到RNA），两组样本比较，实验组样本提取效率更高，差异有统计学意义，P＜0.05。见表1。

表1 提取效率的比较[n（%）]

2.2 组间样本重复性的比较

取同一份样本用两种不同的方法连续提取10次RNA，计算RNA含量的对数值以及10次提取的变异系数。结果显示，实验组患者为7.82，变异系数为16.93%；对照组患者RNA定量为6.79，变异系数为38.64%。实验组患者的变异系数小于对照组，重复性高。

3 讨论

丙型肝炎危害大，并发症严重，如果不及时诊断易形成肝硬化，威胁患者的生命健康安全，因此，该病受到临床的较大重视。研究证明，检测丙型肝炎的RNA是一种高效的特异性检测方法，可做出明确的诊断[6-7]。检测RNA大多采用临床最新提出的PCR方法，该方法科学严谨，操作过程不易受到其他因素的干扰或者污染，可以精确地检测出送检血清中是否含有丙型肝炎病毒的RNA并测量出其具体数值；而且PCR检测结果测定较迅速，节约时间，过程也比较简便，易于在临床推广和普及[8]。

本研究使用的荧光定量PCR的检测技术采用事先提取出的病毒RNA进行扩增培养，可以对其RNA做出精确的检测，已经成为临床的常用检测手段。在进行PCR检测前，首先需要提取出病毒的一部分RNA作为检测扩增的模板，而病毒RNA的提取方式有多种，本次研究选取了最常用的两种，即核酸提取柱的方法以及氯仿—异丙醇提取方式。相关资料显示，前一种方式的提取效率以及重复性更高。笔者分析认为，核酸提取柱的方法有这些优点主要与以下原因有关：（1）该方法在提取过程中需要加入RNA酶的抑制剂，可以有效地降低RNA分解酶的活性，减少RNA的降解，提高了RNA在标本血清中的浓度。（2）氯仿—异丙醇提取方法操作更加繁琐，操作步骤较提取柱的方式更多，需要多次离心与更换离心管，在多次的震荡离心过程中，极易造成RNA的丢失与降解，使最终的提取浓度过低而无法检测。（3）提取柱提取方法加入的裂解液中含有帮助RNA凝聚沉淀的助沉剂，可以促进RNA凝聚成固态物质并吸附在提取柱中的吸附膜上，有利于减少RNA的丢失，增加提取RNA的量。本次研究中，采用核酸提取柱的方式提取RNA的实验组血清标本，RNA的提取效率高于对照组，差异有统计学意义，P＜0.05；实验组患者也具有更高的重复性，P＜0.05。这些实验结果佐证了以上的分析。

综上所述，使用荧光定量PCR的方法可以比较好的比较氯仿—异丙醇以及核酸提取柱对HCV RNA提取的效果差异，核酸提取柱的方式提取RNA效率更高，重复性更好。

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