川芎挥发油化学成分GC-MS分析及抗氧化活性研究

李生茂 刘 琳 潘 媛 敖 慧* 唐友爱

1.川北医学院药学院，四川 南充 637000；2.川北医学院药物研究，四川 南充 637000； 3. 川北医学院附属医院内分泌科，四川 南充 637000；4.成都中医药大学，四川 成都 611137

川芎为伞形科藁本属多年生草本植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，始载于《神农本草经》，中医认为其性温，味辛，归肝、胆、心包经，具有活血行气、祛风止痛的功效[1-3]。现代研究显示[4-11]，挥发油是川芎主要的活性物质之一，其含有苯酞类、烯萜醇及脂肪酸类等类化学成分，具有解热、镇痛、镇静、解痉、改善血液流变、降血压、抗缺血再灌注损伤及抗氧化等多种药理作用。其中，抗氧化是川芎挥发油重要的活性之一，与其体内对抗实验动物脑缺血再灌注损伤的作用关系密切[11-12]，但目前有关川芎挥发油的研究，多集中在不同提取方法基础上的化学成分比较，或单纯的药效评价，而关于其体外抗氧化活性的研究报道较少。基于此，本实验在水蒸气蒸馏法获得川芎挥发油的基础上，采用GC-MS分析其化学成分，并采用DPPH、ABTS法观察其抗氧化活性，以期为川芎挥发油的进一步开发利用提供一定的参考。

1 材料与仪器

1.1 材料 川芎药材购于成都五块石中药材批发市场，经成都中医药大学陈璐副教授鉴定为川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。正己烷(国药集团化学试剂有限公司，批号：T20100928)；无水硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20140114)；1，1-二苯基苦基苯肼(sigma公司，批号：034K1071)， 芦丁(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：130824)；2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(aladdin 公司，批号：L1619007)；过硫酸钾(aladdin公司，批号：A1719017)，甲醇(成都市科龙化工试剂厂，批号：201309230)，水为蒸馏水(自制)。1.2 仪器 Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；Agilent GC-MSD工作站(美国安捷伦公司)；Ohaus Discovery十万分之一电子分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；Epoch 微孔板分光光度计(美国BIOTEK 公司)。

2 方法与结果

2.1 川芎挥发油的制备 取川芎药材粉碎，过20目筛，称取粗粉约200g，置2000mL圆底烧瓶中，加入1200mL蒸馏水，按《中国药典》2015年版一部挥发油测定法进行，水蒸汽蒸馏5h，得川芎挥发油约0.71mL。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 分析条件 GC条件：载气为氦气；体积流量1.0mL/min；程序升温，初始温度50℃，保持2min；10℃/min速率升至120℃，保持8min；5℃/min速率升至180℃，保持8min；20℃/min速率升至260℃，保持4min，分流进样，分流比：1∶60；进样量1μL；进样口温度280℃。

MS条件：EI电离；电子能量70 eV；离子源温度220℃；全扫描方式。

2.2.2 样品测定 取“2.1”项下制备样品，加正己烷稀释，用无水硫酸钠除去水分，0.45μm微孔滤膜过滤，按“2.2.1”项下色谱条件分析，测定川芎挥发油的总离子流图，并通过NIST08质谱数据系统检索并结合文献报道[13-16]，确定各色谱峰代表的化学成分。川芎挥发油中共检出73个色谱峰，鉴定了其中的33个色谱峰，其峰面积之和占总峰面积的85.15%，其中烷烃类成分占0.52%，烯烃类成分占9.62%，酚类成分占2.21%，醇类成分占5.33%，醛酮类成分占1.89%，酯类成分占65.04%(其中内酯类成分为63.31%)。结果见表1，图1。

表1 川芎挥发油化学成分及相对含量

续表

表1 川芎挥发油化学成分及相对含量

续表

表1 川芎挥发油化学成分及相对含量

2.3 体外抗氧化活性测定

2.3.1 清除DPPH自由基 参照文献方法[17-18]并略做修改，称取适量DPPH加甲醇配制成浓度为170μmol/L的溶液，避光保存。取川芎挥发油样品或芦丁适量，加甲醇溶解并配制成一定浓度的供试品溶液。取0.15 mL供试品溶液与0.15mL DPPH溶液置96孔板，混匀后室温避光放置60 min，517nm处测定吸收度A1；同时测定0.15 mL供试品溶液+0.15 mL甲醇的吸收度A0，0.15 mL甲醇+0.15 mL DPPH溶液的吸收度A2，按公式计算清除率：DPPH自由基清除率=[1-(A1-A0)]/A2×100%。以清除率(Y)对药物浓度(X)进行回归，根据对数函数方程求出清除率为50%时药物的浓度(IC50)，川芎挥发油清除DPPH自由基的IC50为0.2325mg/mL。同法测定阳性对照芦丁的IC50值为3.8888μg/mL，结果见图2，图3。

2.3.2 清除ABTS自由基 参照文献方法[17-18]并略做修改， 将10 mL 2 mM ABTS水溶液与100 μL 70 mM过硫酸钾溶液混合，室温避光放置12 h，得ABTS储备液。使用前用甲醇稀释成工作液，使在734nm波长下的吸光度为(0.70±0.05)。取川芎挥发油样品适量，加甲醇溶解并配制成一定浓度的供试品溶液。测定时，取0.045mL供试品溶液+0.155mL ABTS溶液置96孔板，混匀后室温避光放置20min，734nm处测定吸收度A1；同时测定0.045mL供试品+0.155mL甲醇的吸收度A0和0.045mL甲醇+0.155mL ABTS溶液的吸收度A2，按公式计算清除率：ABTS自由基清除率=[1-(A1-A0)]/A2×100%。以清除率(Y)对药物浓度(X)进行回归，根据对数函数方程求出清除率为50%时药物的浓度(IC50)，川芎挥发油清除ABTS自由基的IC50为0.1763mg/mL，同法测定阳性对照芦丁的IC50值为5.1618μg/mL，结果见图2，图3。

3 结论

实验采用水蒸气蒸馏法提取川芎挥发油，并采用GC-MS对其化学成分进行分析，共检测出73个色谱峰，结合文献报道及NIST08质谱数据系统检索鉴定了其中33个化合物的结构，所鉴定的化合物色谱峰峰面积之和占总峰面积的85.15%，可以较好地代表川芎挥发油的化学成分特征。而从已鉴定的化合物结构类型来看，川芎挥发油中含量最高的是以Z-藁本内酯(46.17%)为代表的酯类化学成分，占总峰面积的65.04%(其中内酯类成分为63.31%)，其它类成分含量高低依次为烯烃类、醇类、酚类、醛酮类和烷烃类化学成分。

DPPH自由基法、ABTS自由基法是目前常用的研究药物对自由基清除作用的方法之一[19-20]。笔者结合文献报道[17-18]，在前期研究基础上，采用基于96孔板结合酶标仪检测的方法对川芎挥发油清除DPPH自由基、ABTS自由基的抗氧化活性进行评价，与常用的基于紫外分光光度计测定的清除自由基活性方法比较[11]，具有操作简便，节省试剂和样品，并可同时测定多个样品等优点。结果显示，川芎挥发油在实验浓度范围内，均具有不同程度的清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性，并具有较好的量效依赖关系，但其对两种自由基的清除活性均小于阳性对照芦丁。

实验在采用GC-MS分析川芎挥发油化学成分的基础上，仅观察了其体外清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性，而川芎挥发油对其它自由基有无清除作用及其抗氧化活性物质基础尚不清楚，值得进一步研究。实验结果可为川芎挥发油的进一步开发利用提供一定的参考。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志(第五五卷第二分册)[M]. 北京: 科学出版社, 1985: 239.

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(2015年版一部)[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 40-41.

[3]宋平顺, 马潇, 张伯崇, 等. 芎藭(川芎)的本草考证及历史演变[J]. 中国中药杂志, 2010, 25(7): 434-436, 446.

[4]杜旌畅, 谢晓芳, 熊亮, 等. 川芎挥发油的化学成分与药理活性研究进展[J]. 中国中药杂志, 2016, 41(23): 4328-4333.

[5]张达磊, 李桂生. 川芎挥发油的研究进展[J]. 时珍国医国药, 2005, 16(7): 664-666.

[6]金玉青, 洪远林, 李建蕊, 等. 川芎的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中药与临床, 2013, 4(3): 44-48.

[7]朱尧, 刘溦溦, 顾宁, 等. 川芎的活性成分及其心血管系统保护作用研究进展[J]. 时珍国医国药, 2016, 27(7): 1701-1704.

[8]谢秀琼, 詹珂, 尹蓉莉, 等. 川芎挥发油的研究进展[J]. 时珍国医国药, 2007, 18(6): 1508-1510.

[9]刘露丝, 岳美颖, 李文兵, 等. 当归油与川芎油的化学成分及其对急性化学性脑损伤保护作用差异研究[J]. 中药药理与临床, 2016, 32(6): 105-108.

[10]杨玉霞. 当归、川芎、石菖蒲挥发油化学成分分析及抗氧化活性研究[D]. 长春: 吉林大学,2015.

[11]凌婧, 邓文龙, 张杰, 等. 川芎油对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用[J]. 中药药理与临床, 2008, 24(1): 39-41.

[12]盛艳梅, 孟宪丽, 李春雨, 等. 川芎挥发油对大鼠大脑皮层神经细胞体外存活及脑缺血再灌注损伤的影响[J]. 时珍国医国药, 2012, 23(3): 536-538.

[13]王书妍, 张丽, 包玉敏, 等. 川芎挥发油化学成分GC/MS分析[J]. 光谱实验室, 2010, 27(6): 2174-2176.

[14]谢静, 张浩, 易涛, 等. 高效液相和气质联用色谱法检测不同方法提取川芎挥发油的化学成分[J]. 中国医院药学杂志, 2008, 28(6): 418-421.

[15]吴琦, 杨秀伟. 国家中药材GAP基地产川芎挥发油化学成分的GC-MS分析[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(3): 276-280.

[16]陈友鸿, 莫尚志, 李洁仪, 等. 川芎挥发油成分研究[J]. 中药材, 2004, 27(8): 580-582.

[17]恽祥惠, 邢丽娜, 李云, 等. 建立基于96孔板检测的FRAP法和DPPH法及其在橘核抗氧化活性研究中的应用[J]. 时珍国医国药, 2014, 25(5): 1275-1278.

[18]Yu-Ming Chung, Hui-Chun Wang, Mohamed El-Shazly, et al. Antioxidant and Tyrosinase Inhibitory Constituents from a Desugared Sugar Cane Extract, a Byproduct of Sugar Production[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011(59):9219-9225.

[19]王晓宇, 杜国荣, 李华. 抗氧化能力的体外测定方法研究进展[J]. 食品与生物技术学报, 2012, 31(3): 247-252.

[20]张献忠, 黄海智, 钟烈洲, 等. 植物提取物体外抗氧化活性评价方法研究进展[J]. 中国粮油学报, 2012, 27(11): 122-128.