进展期非节段型白癜风患者外周血CD4+T细胞亚群分析

2018-03-06甄昱李珊山

中华皮肤科杂志 2018年1期

甄昱李珊山

130021长春，吉林大学第一医院皮肤科

研究显示，白癜风是以功能性黑素细胞减少为主要特征的一种自身免疫性疾病，以T细胞为主的细胞免疫在白癜风发生发展中起重要作用［1］。其中CD8+T细胞对黑素细胞的损伤作用已获得共识，而CD4+T细胞的改变则相对比较复杂，关于白癜风Th17以及Treg亚群的变化，目前尚存在争议。为了解进展期NSV患者外周血中CD4+T细胞各个亚群的变化，我们对进展期非节段型白癜风（NSV）患者CD4+T细胞亚群特异性表面标志及其相关细胞因子进行了检测，旨在探讨白癜风发生早期外周血CD4+T细胞的免疫状态，以期为临床免疫抑制治疗提供合理依据。

对象与方法

一、对象

进展期NSV组30例，男女各15例，年龄18～45岁，平均28.6岁；就诊前2个月内均未接受糖皮质激素及免疫抑制剂等药物治疗。健康对照组（取自健康志愿者）30例，男女各15例，年龄17～43岁，平均26.1岁。本研究通过吉林大学第一医院医学伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。

二、主要试剂和仪器

人Ficoll淋巴细胞分离液购于美国Sigma-Aldrich公司。淋巴细胞活化试剂盒、FACS calibur流式细胞仪购于美国BD公司。细胞内染色试剂盒、抗人CD4-FITC单抗、抗人干扰素（IFN）-γ-PECy5单抗、抗人IL-4-PE单抗、抗人IL-17A-APC单抗、抗人CD25-PE单抗及抗人CD127-APC单抗、人IFN-γ、IL-4、IL-17A、转化生长因子（TGF）β1均购于美国eBiboscience公司。酶标仪购于美国Bio-Rad公司。

三、方法

1.样本采集：NSV患者及健康对照外周血各5m l，经抗凝处理后，Ficoll密度梯度离心法收集外周血单个核细胞（PBMC）；5 ml外周血不经抗凝处理，按常规方法收集血清后，分装入1.5ml微量离心管内，-80℃冰箱保存备用。

2.细胞表面染色：2×106PBMC（4× 105/管）加入CD4，CD25，CD127流式荧光抗体进行表面染色，4℃孵育 30 min，用0.1%BSA PBS离心洗涤后，FACS Calibur流式细胞仪检测和Flowjo软件分析。

3.淋巴细胞体外活化培养：5×106PBMC用含10%FBS的RPMI1640培养液重悬，计数后，调整细胞浓度，4×105/孔加入96孔板内培养，同时在孔内加入稀释后的淋巴细胞活化试剂，于37℃、5%CO2培养箱内培养6 h，收集细胞，进行细胞表面CD4染色。

4.细胞因子染色：将已完成表面分子染色的细胞用0.1%BSA PBS离心洗涤后，每管加入300μl eBioscience的细胞内染色试剂盒内固定破膜打孔液处理细胞，室温作用30min，破膜打孔液离心洗涤1次，然后用打孔液稀释的细胞因子抗体进行细胞内染色，室温孵育30min，用破膜打孔液离心洗涤2次。FACSCalibur流式细胞仪检测和Flowjo软件分析。

5.ELISA检测血清中细胞因子水平：按照ELISA检测试剂盒说明书，在ELISA板中加入相关细胞因子的包被抗体，4℃过夜。然后用洗液洗板，加入包被液室温孵育1 h，封闭非特异性抗原。再次洗板后，加入倍比稀释后的标准品以及待检测血清样本，室温孵育2 h，再次洗板后，加入捕获抗体，室温作用1 h，洗板，加入显色底物，室温作用30min，加入终止液终止反应。酶标仪读板。

四、统计学方法

实验数据应用Graphpad Prism 5.0软件进行数据处理。CD4+T细胞各亚群的比例、Th1/Treg、Th2/Treg及Th17/Treg比例和分泌的细胞因子水平均用±s表示，各组数据比较采用单因素方差分析以及StudentNewman Keuls检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、外周血CD4+T细胞亚群的分布

图1 流式细胞仪检测进展期非节段型白癜风组（NSV）与健康对照组外周血中CD4+T细胞亚群比例 Th1，Th2及Th17在单个核细胞体外活化后染色，Treg是单个核细胞直接染色

如图1和表1所示，进展期NSV组外周血Th1细胞与Th17细胞的比例均显著高于健康对照组，差异有统计学意义，而Th2和Treg的比例则与健康对照组之间比较，差异无统计学意义。与健康对照相比，Th1/Treg与Th17/Treg的比例显著增高，而Th2/Treg的比例则未发生显著变化，见表2。

二、ELISA检测血清中细胞因子水平

在进展期NSV组血清中，只有IL-17A的水平显著高于健康对照。虽然IFN-γ的含量高于健康对照，但二者比较，差异无统计学意义。IL-4和TGF-β1的水平与健康对照比较，差异无统计学意义。见表3。

讨论

本研究阐述了NSV患者进展期阶段外周循环中Th1，Th2，Th17和Treg CD4+T细胞亚群的改变。我们发现，在NSV处于进展期时，Th1和Th17细胞反应在外周血CD4+T细胞中占主导地位，而Th2与Treg则未发生显著性变化。Th1/Treg与Th17/Treg比例失衡，提示外周循环中效应性T细胞与抑制性T细胞免疫平衡已被打乱，说明机体对黑素细胞自身抗原已失去耐受。

每个CD4+T细胞亚群均可分泌其相应的细胞因子，如Th1细胞分泌IFN-γ，Th2细胞分泌IL-4，Th17细胞分泌IL-17A及Treg分泌TGF-β1。除Treg外，流式细胞检测也是根据这些特异的细胞因子来界定这些细胞亚群：CD4+IFN-γ+Th1，CD4+IL-4+Th2，CD4+IL-17A+Th17。体外实验揭示，上述这4种细胞因子均可在体外影响黑素细胞的正常功能甚至可以影响黑素细胞的存活。据报道，IFN-γ和IL-17A体外都能刺激黑素细胞产生IL-6，进而抑制黑素的产生；IL-4则可直接影响黑素细胞的黑素生成［2］。IFN-γ［3］和 TGF-β1 体外可诱导黑素细胞凋亡［4］，TGF-β1还可以抑制黑素细胞生长。由此推测，这些相应的细胞亚群可能在白癜风的发病过程中发挥作用。

表1 进展期非节段型白癜风（NSV）组与健康对照组外周血中CD4+T细胞亚群分布比较（%±s）

注：n=30。a与健康对照组相比，P＜0.05

表2 进展期非节段型白癜风（NSV）组与健康对照组外周血Th1/Treg，Th2/Treg，Th17/Treg比较（±s）

注：n=30。与健康对照组比较，a P＜0.01；b P＜0.05

组别健康对照组进展期NSV组Th1/Treg 1.32±1.17 2.37±1.42a Th2/Treg 0.31±0.16 0.32±0.13 Th17/Treg 0.29±0.12 0.41±0.21b

表3 进展期非节段型白癜风（NSV）组与健康对照组血清中细胞因子分泌水平比较（±s） ng/L

注：n=30。a与健康对照组比较，P＜0.001。IFN：干扰素；IL：白细胞介素；TGF：转化生长因子

组别健康对照组进展期NSV组IFN-γ（Th1）29.56±14.76 34.95±14.94 IL-4（Th2）0.2868±0.07 0.2911±0.11 IL-17A（Th17）8.66±1.83 23.08±5.80a TGF-β1（Treg）1321±140.8 1121±181.7

本文结果显示，外周血CD4+T细胞中仅Th1和Th17细胞发生了显著变化。有文献报道，在白癜风皮损及外周血PBMC中均发现IFN-γmRNA表达显著增高［3］，提示机体白癜风自身免疫倾向于Th1反应。我们发现，进展期NSV患者外周血中CD4+IFN-γ+Th1细胞比例显著高于健康对照，这一结果不仅排除了同样表达IFN-γmRNA的CD8+T细胞的干扰，而且在蛋白水平上证实了Th1细胞在外周血中的改变。此外，该发现还与在白癜风皮损及皮损周边处发现有分泌IFN-γ的CD4+T细胞［2］的报道相呼应。尽管我们发现外周血中Th1细胞比例增高，但是血清中IFN-γ水平虽略高于健康对照，差异却无统计学意义。这一结果与Singh等［5］不同，他们发现IFN-γ水平显著低于健康对照。IFN-γ虽然主要由Th1细胞分泌，但CD8+T细胞也可以分泌IFN-γ。而我们发现，外周循环中CD8+T细胞并没有发生显著性变化（结果未显示），血清中IFN-γ的总体水平可能是受到CD8+T细胞的影响。因此，仅根据血清中IFN-γ含量及其mRNA表达水平，并不能准确判定外周血中Th1细胞的变化；而细胞因子染色检测的结果更能直接体现Th1细胞在CD4+T细胞中所占的比例改变。

Th17细胞是有别于Th1和Th2的另一个效应性CD4+T细胞亚群，通过分泌IL-17A在多种自身免疫性疾病中发挥作用。随着其在自身免疫性疾病中的作用被认可，人们发现，Th17细胞也参与了白癜风的自身免疫，在白癜风皮损及血清中都发现IL-17表达增高［6-7］。我们的结果显示，进展期NSV患者Th17在外周血CD4+T细胞中比例显著高于健康对照，同时血清中其特异性分泌的细胞因子IL-17A水平也显著高于健康对照。这与Wang等［6］发现Th17细胞在白癜风皮损周边的浸润是相符合的。血清中IL-17A表达增高也与报道一致［7-8］。我们的数据再次证实，Th17细胞参与了白癜风早期发病。

有研究发现，白癜风患者外周血IL-4mRNA表达及血清IL-4水平均显著高于健康对照［9］。也有研究发现，白癜风患者血清IL-4和外周血中Th2细胞特异性转录因子GATA3mRNA表达显著低于正常［10］。有研究报道，白癜风患者血清中IL-4水平很低，无法检测。为了明确白癜风外周血中Th2细胞的变化，我们对Th2细胞及其特异性的细胞因子IL-4与健康对照进行了比较。我们认为，在进展期NSV患者外周血中，Th2细胞比例与健康对照之间没有差异。而与外周血中的比例变化相对应的是，患者血清中IL-4含量亦没有发生显著变化。

作为机体内免疫抑制细胞，Treg在白癜风自身免疫研究中得到广泛关注。一些研究发现，其在白癜风皮损内数量减少［11］，而另一个研究组发现白癜风皮损内其特异性转录因子Foxp3表达增多，但Treg免疫抑制功能降低［12］。还有报道发现，外周血Treg比例显著降低并伴有FOXP3mRNA低表达［13］，或伴有血清TGF-β1低表达［14］。本研究显示，在进展期NSV患者外周血中，Treg的比例及其标志性的细胞因子TGF-β1与健康对照均无显著差异。我们的结果与其他实验室报道的外周血中Treg比例报道存在不一致的情况，可能与各个实验室选取的Treg定义标准略有不同有关。他们是以CD4+CD25+/CD4+Foxp3+作为Treg的界定标准，可是活化后的人CD4+T细胞CD25/Foxp3的表达比例及表达量均会增加，这个标准略有不足；而我们是以CD4+CD25+CD127-作为Treg的标准，似更为严格。我们检测发现，血清中IL-4和TGF-β1含量没有显著性改变，与流式细胞仪检测外周循环中Th2和Treg的比例结果相一致。这些结果进一步支持进展期NSV患者外周血中Th1和Th17的主导作用。

总之，本研究发现，在进展期NSV外周血中，存在Th1/Treg及Th17/Treg细胞比例显著增高，并伴随促炎性细胞因子IL-17A表达水平显著增高，提示效应性CD4+T细胞与抑制性CD4+T细胞之间平衡被打破，机体处于免疫活化状态。Th1和Th17这两种效应性CD4+T细胞，发生了显著变化，推测它们在白癜风发病早期的自身免疫中发挥了重要的作用。而针对它们分泌的特异性的细胞因子进行拮抗阻断，可能是潜在的抑制白癜风自身免疫进展的手段之一。

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