不同来源腐植酸红外光谱的比较研究

魏世平 吴 萌 李忠佩

中国科学院南京土壤研究所 南京 210008

腐殖质是自然界中分布最广泛的有机物，常存在于煤炭、土壤、水体、底泥等介质中[1]。大量研究表明腐植酸是腐殖质中的活性物质，在土壤肥力提升和环境污染修复方面具有重要作用[2～4]。将腐植酸作为生物指标在生态功能方面的研究相对较少，而腐植酸的生物学作用最终被归因于其化学结构的多样性，特别是官能团和元素组成的属性[5]，所以研究腐植酸的结构对于了解腐植酸的功能化学属性意义重大。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）作为一种分子吸收光谱，可以对有机物中含氧官能团进行无损测定，故被评定为有机物定性鉴定与半定量分析的一种实用技术[6～8]。目前，利用红外光谱技术对褐煤和泥炭HA的研究较多[9，10]，而对来源于秸秆堆肥以及湖泊底泥HA的化学结构研究相对较少，特别是对他们之间HA化学结构的差异比较研究更少。

本研究选择了差异较大的褐煤、腐熟秸秆、泥炭和底泥4种材料，通过对其基本元素的测定以及含氧官能团的红外光谱分析，从而对HA的化学结构进行比较研究，进而更深入地了解HA的化学组成，旨在为HA的生物活性利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源及HA的提取

供试材料包括褐煤、腐熟秸秆、底泥和泥炭。

褐煤购自中国内蒙古自治区乌海市同升商贸有限责任公司；腐熟秸秆来自水稻秸秆的腐熟堆肥，其腐解过程为：添加尿素将破碎后的秸秆碳氮比调节至50，再添加适量的已活化EM菌液（秸秆发酵菌剂），28 ℃培养，直至腐熟，堆肥时间为1个月；底泥采自中国镇江太湖湖心位置，采样坐标为31°27′N，120°01′E，湖底表层40 cm以下土样；泥炭来自印尼，属于木本泥炭。所有样品经风干后，过60目筛备用。

根据HA在酸碱中溶解度的不同，HA的提取方法如下[11，12]：用0.1 M的Na4P2O7-NaOH浸提液提取，固液比为1∶10，振荡过滤后，保留溶液；用6 M HCl将溶液的pH值调至1，保留沉淀，再用0.1 M NaOH重复溶解沉淀，再次用HCl将溶液的pH值调至1，保留沉淀；用0.3 M HF和纯水分别冲洗2次，保留HA沉淀，装入透析袋，在蒸馏水中透析，直至用AgNO3检测不出Cl-为止；透析后的沉淀经﹣45 ℃冷冻干燥96 h后，室温保存备用。

1.2 碳氮含量以及红外图谱的测定方法

碳、氮元素的含量分析是由德国ELEMENTAR vario MACRO机器完成测定，上样量为20 mg，每种材料HA至少测定2个平行。测量时氧化管和还原管的温度分别设置为1150 ℃和850 ℃。

材料HA的红外光谱是由美国Thermo Scientif i c Nicolet iS10红外光谱仪检测并采集4000～400 cm-1范围的图谱而来。称取2 mg样品，每个样品测定3个平行，按照1∶100添加干燥的溴化钾粉末，压片后进行上机检测，具体方法参考Wu等[12]研究。

1.3 数据处理与统计分析

HA红外图谱用OMNIC软件对吸光度曲线进行标准化后进行峰面积积分处理分析；为了更好地比较材料HA之间芳香化合物的相对含量和脂族化程度的相对高低，引入Iar、2920/1710、2920/1600和2920/2850 4种衡量指标[12，13]，计算公式如下：

Iar= 1600 cm-1处峰面积/（2920 cm-1处峰面积+2850 cm-1处峰面积）；

2920/1710=（2920 cm-1处 峰 面 积 +2850 cm-1处峰面积）/1710 cm-1处峰面积；

2920/1600=（2920 cm-1处 峰 面 积 +2850 cm-1处峰面积）/1600 cm-1处峰面积；

2920/2850=2920 cm-1处峰面积/2850 cm-1处峰面积。

不同材料HA相关指标数据间的方差分析及多重比较由SPSS 16.0来完成；相关数据图片用Origin 8.0进行绘制。

2 结果与讨论

2.1 碳氮含量的测定结果与分析

所选材料HA的碳、氮元素含量见表1。从不同材料中提取出的HA在含碳量、含氮量、碳/氮上存在显著差异。泥炭HA含碳量最高，为57.36%，显著高于其他材料HA。只有腐熟秸秆HA含碳量显著小于其他材料，为49.28%。腐熟秸秆和底泥的HA含氮量显著大于褐煤和泥炭HA，并且底泥HA的含氮量达到泥炭HA的5倍多，为5.02%；泥炭和褐煤的HA碳氮比显著高于腐熟秸秆HA和底泥HA，其中泥炭HA的碳氮比约为腐熟秸秆HA的6倍，为69.32。

4种材料HA中，由于泥炭HA的含碳量最高而含氮量最低，所以导致泥炭HA碳氮比最大。与前人的研究结果相比，从内蒙褐煤中提取纯化的HA，与Dong等[14]研究中同样来自内蒙的褐煤和李鹏[9]研究中所用褐煤（来自湖南）其碳氮含量相当，但是在Peuravuori等[15]关于褐煤HA结构特性的研究中，HA含碳量为607～641 g/kg，要高于本研究所用褐煤材料。在Yarkova等[16]关于泥炭HA结构研究中，泥炭HA的含碳量与本试验研究结果相似，而含氮量是本研究的3倍。本研究的底泥来自太湖，由于没有关于同一采样来源的类似研究，所以在碳氮含量上无法比较。

表1 不同材料HA碳、氮元素含量Tab.1 The carbon and nitrogen content of humic acid from diあerent materials

2.2 红外图谱的结果与分析

材料HA的红外光谱图见图1，图中标出13种不同波数的吸收峰。在4种HA中共同检测到的吸收峰有6处，分别为：代表OH基团伸展的3400 cm-1处，代表脂肪族CH2不对称、对称的C-H伸展的2920 cm-1、2850 cm-1处，代表COOH中C=O伸展的1710 cm-1处，代表芳香族C=C骨架振动的1600 cm-1处，以及代表COOH基团的C-O伸缩和O-H变形、芳香醚和苯酚的C-O伸展的1240 cm-1处。其余7处吸收峰只在部分材料HA的红外图谱中出现：如代表酚羟基的O-H变形和C-O伸展的1420 cm-1处，只在腐熟秸秆和泥炭HA中出现；代表多糖和类多糖的C-O伸展的1030 cm-1处，只在腐熟秸秆和底泥HA中出现。另外，腐熟秸秆HA中还检测到4处独有的吸收峰，分别为：代表酰胺C=O伸展的1660 cm-1处，代表芳香族C=C伸展的1510 cm-1处，代表脂肪族的C-H变形的1455 cm-1处，以及代表醇和醚基团的C-O伸展的1125 cm-1处。但是腐熟秸秆HA却是唯一没有检测到1380 cm-1处吸收峰的材料，1380 cm-1所代表的官能团为芳香族CH2和CH3的C-H变形或 COO-基团的反对称伸缩[12，17，18]。

计算各材料HA相应吸收峰的峰面积，各峰面积的相对比例列于表2，从峰面积的相对比例上可以看出，不同来源HA在不同吸收峰处的相对强度不同，表明不同物料HA在含氧官能团或结构单元上存在数量上的差异[19]。其中，褐煤HA含有最多的羧基（1710 cm-1）；腐熟秸秆HA的吸收峰最丰富，表明新形成的秸秆HA所含有的酰胺类、醇类、酚类、多糖等化合物较多；底泥HA在1710 cm-1处的峰面积比例较小，而在1240 cm-1处峰面积比例最大，表明其中芳香醚和苯酚的含量最多；泥炭HA的芳香族C=C骨架振动（1600 cm-1）最明显，表明其组成中芳香族化合物含量较多。

图1 不同材料HA的红外光谱Fig.1 Infrared spectroscopy of humic acid from diあerent materials

表2 不同材料HA红外图谱吸收峰波数以及峰面积的相对比例Tab.2 Infrared spectroscopy absorption peak wave number and the peak area relative proportion of humic acid from diあerent materials

4种材料HA的Iar值绘于图2，根据Wu等[12]关于不同连作年限土壤HA红外结构与其抑菌活性的关系研究，将Iar用于描述材料HA中芳香化合物的相对含量。图2中褐煤HA的Iar最高，为10.02；泥炭HA次之，为7.16；腐熟秸秆HA最低，为0.08。方差分析结果表明，4种HA的Iar值存在显著性差异，表明褐煤HA芳香化合物的相对含量显著高于泥炭HA、底泥HA和腐熟秸秆HA，而腐熟秸秆HA中芳香化合物含量在4种材料中最低 [9，15，16，20，21]。

图2 不同材料HA的Iar值Fig.2 Iar of HA from diあerent materials

图3描绘的是4种材料HA与脂族性相关的参数。2920/1710、2920/1600可以用来表示化合物分子结构的脂族化，2920/2850表示的是脂族链烃中聚亚甲基碳和末端甲基碳的比例，可以用来反映脂族链的长短或分支情况[13]。

图3 不同材料HA的脂族性参数Fig.3 Aliphatic parameter of HA from diあerent materials

图3 显示腐熟秸秆HA 2920/1710、2920/1600和2920/2850的比值均显著高于其他材料，分别为3.77、12.05、15.15，表明腐熟秸秆HA的脂族化程度最高，同时说明其脂族链相对较长或分支相对较多。这与肖燏杰[6]关于水稻秸秆腐解产生溶解性有机质的分组组成的研究结果一致，其研究中发现疏水中性的HA除了含有较多的脂族类烷烃，还有少量酰胺类、芳香族不饱和物质和碳水化合物。褐煤HA和泥炭HA的2920/1710、2920/1600比值最低，分别为0.21、0.10和0.39、0.14，表明他们的脂族化程度最低，这与Iar分析的结果一致。虽然泥炭HA的2920/1710、2920/1600比值较低，但是2920/2850比值与腐熟秸秆HA没有差异（P＜0.05），为14.71，表明其所含较少的脂肪族化合物中可能拥有最长的脂族链或最多的分支。

3 结论

通过对4种材料HA的元素组成和含氧官能团进行研究分析得到：

（1）泥炭HA和褐煤HA具有较高的含碳量和较低的含氮量，故其碳氮比相对较高；而腐熟秸秆HA和底泥HA的含碳量和含氮量具有相反的趋势，故碳氮比相对较低。

（2）褐煤HA和泥炭HA的结构中芳香族化合物含量相对较高、脂族化程度相对较低，而腐熟秸秆HA和底泥HA中芳香族化合物含量相对较低、脂族化程度相对较高。

（3）腐熟秸秆HA脂族化程度最高，同时腐熟秸秆HA和泥炭HA中所含有的脂族链相对较长或分支相对较多。

在此基础上，还需进一步研究4种材料HA的实际改良效果，包括作为土壤调理剂、稳定剂，盆栽土壤的组成，颗粒肥料的组成，悬浮液体肥料添加剂，以及对植物生长作用的研究等，从而拓展其在农业生产上新的应用领域。

[ 1 ]徐丽娜. 厌氧条件下腐殖酸对Fe（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）的微生物还原的影响[D]. 中国科学院南京土壤研究所硕士学位论文，2008.

[ 2 ]Plaza C, Senesi N. The effect of organic matter amendment on native soil humic substances[M]//Nicola S, Xing B S, Huang P M. Biophysicochemical processes involving natural nonliving organic matter in environmental systems. John Wiley & Sons, 2009: 147～181.

[ 3 ]杨瑞吉，杨祁峰，牛俊义. 表征土壤肥力主要指标的研究进展[J]. 甘肃农大学报，2004，39（1）：86～91.

[ 4 ]李忠佩，徐丽娜，车玉萍. 溶液培养条件下腐殖酸对Cr（Ⅵ）微生物还原的影响[J]. 土壤，2015，47（2）：356～360.

[ 5 ]Loffredo E, Berloco M, Casulli F, et al. In vitro assessment of the inhibiton of humic substances on the growth of two strains of Fusarium oxysporum[J]. Biology and Fertility of Soils,2007, 43(6): 759～769.

[ 6 ]肖燏杰. 水稻秸秆腐解产生溶解性有机质的分组组成及其环境意义[D]. 四川农业大学硕士学位论文，2009.

[ 7 ]Giovanela M, Crespo J S, Antunes M, et al.Chemical and spectroscopic characterization of humic acids extracted from the bottom sediments of a Brazilian subtropical microbasin[J].Journal of Molecular Structure, 2010, 981(1):111～119.

[ 8 ]Qu X X, Xie L, Lin Y, et al. Quantitative and qualitative characteristics of dissolved organic matter from eight dominant aquatic macrophytes in Lake Dianchi, China[J]. Environ. Sci. pollut.Res., 2013, 20(10): 7413～7423.

[ 9 ]李鹏. 褐煤胡敏酸与天然铁、钛、硅氧化矿物的吸附研究[D]. 中南大学硕士学位论文，2012.

[ 10 ]Heller C, Ellerbrock R H, Rosskopf N, et al.Soil organic matter characterization of temperate peatland soil with FTIR-spectroscopy: eあects of mire type and drainage intensity[J]. European Journal of Soil Science. 2015, 66(5): 847～858.

[ 11 ]斯蒂文森. 腐殖质化学[M]. 北京：北京农业大学出版社，1994.

[ 12 ]Wu M, Song M Y, Liu M, et al. Fungicidal activities of soil humic/fulvic acids as related to their chemical structures in greenhouse vegetable fields with cultivation chronosequence[J].Scienti fi c Reports, 2016(6): 32858.

[ 13 ]肖彦春，窦森. 土壤腐殖质各组分红外光谱研究 [J]. 分析化学，2007，35（11）：1596～1600.

[ 14 ]Dong L H, Yang J S, Yuan H L, et al. Chemical characteristics and influences of two fractions of Chinese lignite humic acids on urease[J].European Journal of Soil Bilology, 2008, 44(2):166～171.

[ 15 ]Peuravuori J, Žbánková P, Pihlaja K. Aspects of structural features in lignite and lignite humic acids[J]. Fuel Processing Technology, 2006,87(9): 829～839.

[ 16 ]Yarkova T A, Gyul’maliev A M. Average structural model of humic acids of peat origin[J].Solid Fuel Chemistry, 2012, 46(5): 279～281.

[ 17 ]窦森. 土壤有机质[M]. 北京：科学出版社，2010.

[ 18 ]Monda H, Cozzolino V, Vinci G, et al. Molecular characteristic of water-extractable organic matter from different composted biomasses and their effects on seed germination and early growth of maize[J]. Science of the Total Environment,2017, 590～591: 40～49.

[ 19 ]窦森，姜岩. 土壤施用有机物料后重组有机质变化规律的探讨——Ⅱ.对重组有机质中腐殖质组成和胡敏酸光学性质的影响[J]. 土壤学报，1988，25（3）：252～261.

[ 20 ]窦森，陈恩凤，谭世文，等. 不同来源胡敏酸的结构表征[J]. 吉林农业大学学报，1989，11（2）：50～56.

[ 21 ]徐丽娜，李忠佩，车玉萍. 淹水厌氧条件下腐殖酸对红壤中铁异化还原过程的影响[J].环境科学，2009，30（1）：221～226.