胃液固有荧光光谱在胃癌诊断中的应用进展

刘 健 闫秀娥 综述 周丽雅 林三仁 审校

(北京大学第三医院消化科，北京 100191)

针对胃癌诊断方法的探索，已历经数十年的研究[1]。我课题组前期研究[2,3]表明，胃癌患者的胃液荧光光谱荧光强度较胃良性病变患者显著增强，并建立了通过胃液荧光光谱区别胃癌与胃良性病变的方法。针对荧光增强现象机制的研究，先后从胃液中分离提取并鉴定出3个有价值且可用于胃癌及早期胃癌诊断和筛查的候选肿瘤标志物，即3种芳香族氨基酸(aromatic amino acids，AAAs)[4,5]。本文对胃液荧光光谱及胃液荧光物质在胃癌诊断和筛查中的应用进展作一综述，以期对提高我国早期胃癌的诊治水平有所帮助，对广大临床和科研工作者有所启发。

1 血清固有荧光光谱对胃癌的诊断价值

20世纪80年代，Leiner和Grigorovich等[6,7]分别分析了肿瘤患者与正常人之间血清荧光光谱的差异，试图找到一种肿瘤诊断的新方法，但没有取得满意的结果。1990年以来，我课题组对血清和胃液荧光光谱在胃癌诊断中的应用价值进行了一系列研究。李成刚等[8]测定1191例胃内各类病变患者的血清固有荧光光谱，并分析胃癌患者血清荧光光谱的变化规律。结果表明，胃癌组血清第二荧光峰强度(fluorescence intensity of the second peak，P2FI)显著高于胃内其他病变组(P<0.01)。但由于影响血清荧光光谱的干扰因素很多，特异性可能受影响，故改用胃液进行荧光光谱检测，减少混杂因素，直接反映胃部情况[9]。

2 胃液固有荧光光谱对胃癌的诊断价值

胃液由胃黏膜上皮产生，并直接与胃黏膜上皮接触，必定含有许多反映黏膜上皮代谢状态的信息。当胃黏膜发生癌变后，代谢状态也随之发生变化，从而释放一些内源性荧光物质，引起胃液荧光光谱发生变化[10]。王晶桐等[11]的研究共纳入248例胃内各类病变患者，结果显示胃癌与胃良性病变患者稀释胃液的固有荧光光谱存在显著差异：胃癌组胃液第一荧光峰强度(P1FI)显著升高，而P2FI显著减低。严海密和董琳等[12,13]的研究也证明胃液荧光分析对胃癌及癌前病变的诊断有一定的特异性。严海密等[12]收集881例胃良恶性疾病患者的胃液，用胃液荧光分析系统检测胃液荧光强度，结果表明，以0.85(ROC曲线最佳临界点)为判别标准，诊断胃癌的灵敏度为81.5%，特异度为78.7%，假阳性率为18.5%，假阴性率为21.3%；董琳等[13]收集980例胃良恶性疾病患者的胃液，同样应用胃液荧光分析仪检测胃液荧光强度，结果表明，以0.85为判断标准，诊断胃癌的灵敏度为82.0%，特异度为79.2%。此外，诊断重度萎缩性胃炎伴肠化及胃黏膜不典型增生患者的判别标准与0.85相近。孙晓宁等[14]对胃癌高发地区人群进行大规模(1506例)随机双盲对照研究，胃液荧光光谱诊断胃癌的灵敏度、特异度和准确度分别为83.2%、80.7%和82.0%，提示这是一种可以用于胃癌临床筛查的安全、简便、经济、有效的方法。

郭慧兰等[15]以288 nm为激发光，检测300～800 nm范围内的胃液固有荧光光谱，比较胃癌与胃良性病变患者的胃液固有荧光光谱，再次证实，胃癌患者胃液P1FI较胃良性病变患者显著增强(P<0.05)。当以P1FI≥39.0 AU(absorbance unit)为胃癌的诊断标准时，其用于胃癌诊断的灵敏度为85.0%，特异度为91.9%，准确度为90.8%。李渊等[16]对202例胃内各类病变患者的稀释胃液进行固有荧光光谱分析，结果表明，胃癌与胃良性病变患者的固有荧光光谱峰位及峰数基本相同，而胃癌患者的胃液P1FI较胃良性病变患者显著增强(图1)。

图1 胃良性病变(a)和胃癌(b)患者稀释胃液固有荧光光谱[16]注：FI：荧光强度；P1F：第一荧光峰；P2F：第二荧光峰；P3F：第三荧光峰

孟灵梅等[17]的研究表明，稀释浓度为1∶20、磷酸盐缓冲溶液pH值为11.0、液氮保存不超过1个月时，胃液固有荧光光谱检测结果较好。张月宁等[18]应用上述标准化检测方法，对118例胃内各类病变患者的稀释胃液进行固有荧光光谱检测，根据ROC曲线进行分析，当选取PlFI≥78.5 AU为诊断标准时，其用于胃癌诊断可获得较好的灵敏度(77.4%)和特异度(78.8%)。

3 胃液固有荧光光谱联合其他检查对胃癌的诊断价值

徐志洁等[19]的研究表明，在45岁以上的受检者中，以P2FI≥111.8 AU或胃液pH值≥5.0作为胃恶性病变的判定标准，其诊断胃癌的灵敏度为83.3%，特异度为71.4%。闫秀娥等[20]在检测稀释胃液固有荧光光谱的基础上，采用甲基化特异性PCR的方法对p16基因启动子区域和死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAPK)基因的甲基化状态进行检测，结果表明，p16和DAPK基因甲基化与稀释胃液固有荧光光谱检测结合后诊断胃癌的灵敏度和特异度分别提高到95.6%和97.8%，提示胃液固有荧光光谱和DNA甲基化状态联合检测对胃癌诊断具有良好的临床应用价值。

4 胃液高效液相荧光光谱对胃癌诊断和筛查的应用价值

高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)是20世纪70年代迅速发展起来的一种物理化学分离分析技术，具有分离分析效能高、速度快、检测灵敏度高等优点，是目前在国际分析化学界各种色谱模式中应用最广、发展最快的领域。液相色谱-质谱联用技术使液相色谱的高分析能力和质谱的高鉴定能力相结合，对复杂样品体系特别是生物医学领域的研究提供了更加有效的方法。

郭慧兰等[21]应用HPLC法对251例胃内各类良恶性病变患者的稀释胃液高效液相荧光光谱进行检测，包括进展期胃癌39例、重度异型增生1例和胃内各类良性病变211例，结果显示，P1FI用于诊断进展期胃癌先验概率的灵敏度为92.5%，特异度为92.4%；后验概率的灵敏度为85.0%，特异度为89.1%。张月宁等[22]应用Mono Q离子交换HPLC法检测稀释胃液高效液相荧光光谱，比较早期胃癌与胃良性病变患者间胃液荧光峰的差异。结果表明，于保留时间30～32 min之间规律出现一个强度最大的荧光峰，早期胃癌组该荧光峰强度的平均值显著高于胃良性病变组(P<0.001)。建立ROC曲线，取0.12 V为界值，诊断早期胃癌的灵敏度为91.2%，特异度为87.8%，准确度为89.3%，提示HPLC法对早期胃癌也具有较高的诊断价值。尽管胃癌患者的胃液具有特异性荧光光谱，但引起胃液荧光光谱改变的内源性荧光物质尚待明确。

5 胃液荧光物质的鉴定及其对胃癌诊断和筛查的应用价值

质谱(mass spectrum，MS)技术是一种常用的定性分析工具，可用于获取各种化合物的结构信息，如化合物的精确分子量、元素组成和序列、分子结构等。在生物样品分析中，应用高效液相色谱与质谱联用，可充分发挥高效液相色谱的分离功能和质谱的质量结构分析功能，进行蛋白质和多肽的序列分析、多糖的结构测定及寡核苷酸、核酸的分析等。

为从胃癌患者胃液中发现特异性荧光物质，并探讨其作为胃癌诊断标志物的潜能，李渊等[23]收集10例胃癌和10例非胃癌患者的胃液，浓缩后进行高效液相荧光光谱分析，并收集高效液相荧光光谱中保留时间在11.5～12.5 min范围内的荧光物质，再经质谱鉴定，观察到L-色氨酸或其结构类似物可能是参与产生胃良恶性病变患者间胃液荧光光谱差异的物质。马东杰和廉伟等[24,25]的研究进一步支持了这一结果，胃癌组(n=38)有52.6%的患者胃内容物中色氨酸浓度>6.0 mg/L，而在胃良性病变组(n=48)中仅有22.9%的患者胃内容物中色氨酸浓度>6.0 mg/L，2组相比差异显著(P<0.05)。Abasov和Segawa等[26,27]也分别应用放射性纸层析法和HPLC法在胃癌患者的胃液中检测到2种和3种AAAs浓度异常升高。

张月宁等[28]应用正交加速电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)技术分析13份胃液标准品中的物质成分，结果得到13种多肽，经过比较，在现有数据库中未发现与人同源的蛋白质多肽片段。但这13条肽段中均含有发色基团酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或含有苯环的脯氨酸。因为这些肽段含有2个以上AAAs，结构致密且距离较近，有利于共振能量的互相传递，造成原子核外离子对发生π-π跃迁，所以可以使荧光增强[29]。

邓凯等[4]应用HPLC法对胃良恶性病变患者的胃液荧光光谱进行检测并比较，确定4个差异性色谱峰，对应的色谱柱保留时间分别为8、12、16.5和33.5 min。定性研究结果表明，在液相色谱串联质谱(LC/MS)分析中，这4个差异性色谱峰的单分子离子的质核比(mass to charge ratio，m/z)分别为182、166、205和265。同时检测它们的子离子谱，上述4个分子的化学成分被解析为酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和丁卡因。该解析结果经磁共振波谱(nuclear magnetic resonance，NMR)分析再次确认。此外，AAAs标准品在色谱柱中的保留时间也与这些差异性色谱峰相吻合。丁卡因是用于胃镜检查前鼻和咽喉部黏膜表面麻醉的麻醉剂，所以不作为内源性荧光物质继续研究。随后，邓凯等进行了一系列的定量研究，以探讨3种胃液AAAs作为胃癌诊断和筛查潜在生物标志物的可行性。邓凯等[3]收集101例胃良恶性病变患者(胃癌33例，胃良性病变68例)的胃液标本，应用HPLC法检测胃液中三种AAAs的含量。胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的浓度分别为胃癌组(54.9±11.0)、(54.3±11.4)和(19.4±4.7)μg/ml，胃良性病变组(8.7±2.6)、(8.8±2.1)和(2.7±1.0)μg/ml。与胃良性病变组相比，胃癌组患者胃液中3种AAAs的浓度均显著升高(P值均<0.01)。应用ROC曲线分析胃液3种AAAs浓度异常升高判别胃癌与胃良性病变的价值，ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为酪氨酸0.838，苯丙氨酸0.856，色氨酸0.816(P值均<0.001)。为进一步探讨3种胃液AAAs浓度异常升高对早期胃癌的判别价值，邓凯等[5]收集49例早期胃癌和70例胃良性病变患者的胃液标本，并应用HPLC法检测胃液中3种AAAs的浓度。结果表明，早期胃癌组中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的浓度较胃良性病变组均显著升高(P值均<0.01)。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸浓度的中位数(P25～P75)分别为早期胃癌组19.4(5.8～72.4)、24.6(11.5～73.7)和8.3(2.1～28.0)μg/ml，胃良性病变组3.8(1.7～7.5)、5.3(2.3～9.9)和1.0(0.4～2.8)μg/ml。使用ROC曲线分析胃液3种AAAs浓度异常升高区分早期胃癌与胃良性病变的价值，AUC分别为酪氨酸0.790(95%CI0.703～0.877，P<0.001)，苯丙氨酸0.831(95%CI0.750～0.911，P<0.001)，色氨酸0.819(95%CI0.739～0.900，P<0.001)。运用ROC曲线对应的理想界值(酪氨酸≥18.8 μg/ml，苯丙氨酸≥9.6 μg/ml，色氨酸≥5.5 μg/ml)判别早期胃癌，其敏感度、特异度和准确度分别为酪氨酸51.0%、94.3%和76.5%，苯丙氨酸79.6%、74.3%和76.5%，色氨酸61.2%、94.3%和80.7%。上述研究结果提示胃液AAAs浓度从胃癌发生的早期就开始升高，可能是胃癌发生的早期事件。由此推测，胃液AAAs可以用作判别早期胃癌的生物标志物。上述研究成果得到2篇综述的大幅引用[30,31]，它们分别发表在蛋白质组学研究领域国际权威期刊Journal of Proteomics和肿瘤学研究领域国际权威期刊Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention上。

刘健等[32]建立并验证基于男女性别比、胃液pH值和AAAs浓度的胃液指数模型。使用该模型诊断胃癌的AUC为0.897(95%CI0.838～0.956)，理想界值、灵敏度、特异度和准确度分别为8.995、83.9%、82.0%和82.5%。更重要的是，该模型也适用于早期胃癌的诊断，其AUC为0.848(95%CI0.771～0.924)。

综上所述，胃良恶性病变患者的胃液固有荧光光谱、高效液相荧光光谱和游离芳香族氨基酸浓度之间存在显著差异，用于胃癌诊断和筛查的灵敏度、特异度和准确度均较高，有望成为一种安全、有效、简便、经济的胃癌诊断和筛查方法。

1 林三仁.荧光光谱检测对胃癌的诊断价值.中华消化杂志，2003,23(1):44-45.

2 Zhou LY,Lin SR,Li Y,et al.The intrinsic fluorescence spectrum of dilute gastric juice as a novel diagnostic tool for gastric cancer.J Dig Dis,2011,12(4):279-285.

3 Deng K,Zhou LY,Lin SR,et al.A novel approach for the detection of early gastric cancer:fluorescence spectroscopy of gastric juice.J Dig Dis,2013,14(6):299-304.

4 Deng K,Lin S,Zhou L,et al.Three aromatic amino acids in gastric juice as potential biomarkers for gastric malignancies.Anal Chim Acta,2011,694(1-2):100-107.

5 Deng K,Lin S,Zhou L,et al.High levels of aromatic amino acids in gastric juice during the early stages of gastric cancer progression.PLoS One,2012,7(11):e49434.

6 Leiner MJ,Schaur RJ,Desoye G,et al．Fluorescence topography in biology.Ⅲ:Characteristic deviations of tryptophan fluorescence in sera of patients with gynecological tumors．Clin Chem,1986,32(10):1974-1978.

7 Grigorovich NA,Slobozhanina EI,Monastyrnaia PL,et al.A method of diagnosing malignant neoplasms based on the natural fluorescence of the blood serum in the ultraviolet and visible regions of the spectrum.Vopr Onkol,1988,34(6):664-668.

8 李成刚,林三仁,周丽雅,等.血清内源性荧光光谱在胃癌诊断中的应用研究.医学研究通讯，1997,26(5):9-11.

9 林三仁,周丽雅,杨雪玲,等.血清内源性荧光光谱在胃癌诊断中的应用.北京医科大学学报，1997,29(4):341-344，368.

10 张冬红,周丽雅.胃液固有荧光光谱检测诊断胃癌研究现状.中国肿瘤，2007,16(4):237-239.

11 王晶桐,周丽雅,丁世刚,等.胃液固有荧光光谱对胃癌诊断价值的初步探讨.中华内科杂志，1998,37(12):34-36.

12 严海密,王铁武,孙 斌,等.荧光胃液分析系统对胃癌诊断的临床应用初步探讨.宁夏医学杂志，2006,28(5):342-344.

13 董 琳,王铁武,施明国,等.荧光胃液分析对胃癌癌前病变诊断的临床研究.胃肠病学和肝病学杂志，2007,16(2):122-123.

14 孙晓宁,林三仁,吕旌乔.胃液固有荧光光谱对胃癌筛查应用价值的研究.中华消化杂志，2004,24(5):10-13.

15 郭慧兰,林三仁,王立新,等.稀释胃液固有荧光光谱对胃癌诊断价值的研究.北京大学学报(医学版)，2003,35(5):540-543.

16 李 渊,周丽雅,叶嗣懋,等.胃液固有荧光光谱对胃癌诊断价值的初步研究.中华内科杂志，2003,42(1):31-33.

17 孟灵梅,周丽雅,林三仁,等.胃液固有荧光光谱诊断胃部恶性病变检测条件的比较.胃肠病学，2006,11(10):590-593.

18 张月宁,孟灵梅,金新莲,等.胃液固有荧光光谱标准化检测方法用于胃癌诊断的意义.胃肠病学和肝病学杂志，2010,19(9):830-833.

19 徐志洁,周丽雅,李 渊.胃液固有荧光光谱、pH值和潜血检测对胃癌诊断价值的临床研究.胃肠病学，2004,9(4):213-216.

20 闫秀娥,周丽雅,林三仁.DNA甲基化和胃液固有荧光光谱联合检测在胃癌诊断中的意义.中华消化杂志，2006,26(11):726-730.

21 郭慧兰,林三仁,王立新,等.胃液高效液相荧光光谱对胃癌诊断的价值.中华消化杂志，2001,21(7):29-31.

22 张月宁,金新莲,孟灵梅,等.高效液相色谱法检测早期胃癌中胃液固有荧光的诊断价值.世界华人消化杂志，2010,18(21):2262-2265.

23 李 渊,周丽雅,郭慧兰.胃癌患者胃液中特异性荧光物质的初步确定.中华消化杂志，2003,23(1):15-18.

24 马东杰,许 旭,廉 伟,等.高效液相色谱法检测胃液中色氨酸和利多卡因.分析化学，2009,37(11):1617-1621.

25 Lian W,Ma DJ,Xu X,et al.Rapid high-performance liquid chromatography method for determination of tryptophan in gastric juice.J Dig Dis,2012,13(2):100-106.

26 Abasov IT.Chromatographic analysis of free amino acids of gastric juice in patients with cancer and other stomach diseases.Neoplasma,1967,14(4):429-434.

27 Segawa K,Nakazawa S,Tsukamoto Y,et al.Amino acid patterns in human gastric juice in health and gastric disease.Jpn J Med,1985,24(3):244-249.

28 张月宁,金新莲,孟灵梅,等.胃癌患者胃液中特异性荧光物质的分离鉴定.中国肿瘤临床，2011,38(1):10-14.

29 Hazra C,Samanta T,Mahalingam V.A resonance energy transfer approach for the selective detection of aromatic amino acids.J Mater Chem C,2014,2:10157-10163.

30 Wu W,Chung MC.The gastric fluid proteome as a potential source of gastric cancer biomarkers.J Proteomics,2013,90:3-13.

31 Wiggins T,Kumar S,Markar SR,et al.Tyrosine,phenylalanine,and tryptophan in gastroesophageal malignancy:a systematic review.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2015,24(1):32-38.

32 Liu J,Lin SR,Li ZP,et al.A novel gastric juice index model for detecting early gastric cancer.Int J Clin Exp Med,2017,10(10):14425-14435.