小麦分蘖成穗数相关分子标记在重组自交系(RIL)群体中的有效性验证及实用性评价

胡洋山，汤颖子，李 治，晏本菊，任正隆，任天恒

(1.四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014； 2.四川农业大学农学院，四川成都 611130)

分蘖成穗是小麦(TriticumaestivumL.)重要的生物学特性，单位面积穗数作为产量三要素之一受到育种家的广泛关注[1]。而单位面积最大分蘖数直接影响单位面积穗数，与其具有极显著相关性，同样对小麦的最终产量有较大的影响[2]。四川省属于我国西南麦区，是典型的雨养农业区，较多的阴天和较少的光照会导致小麦分蘖成穗力弱，单位面积穗数减少，进而造成产量下降[3-4]。本课题组选育的多穗型系列小麦新品种川农12、川农17和川农18在西南麦区种植比例日益增大，这些新品种具有较强的分蘖成穗力，增产潜力高，为打破中国西南小麦生态区“生态穗容量”的限制提供了新的思路[5]。

小麦单位面积最大分蘖数和单位面积穗数是非常复杂的数量性状，受多基因控制且易受到环境影响。目前，有三个控制小麦分蘖的基因( tin1、 tin2、 tin3)分别被定位在1A、2A和3A染色体上[6-9]。Xu等[10]利用高分蘖和矮杆突变体构建的RIL群体，在2D染色体上检测到一个控制分蘖的主效QTL。Shah等[11]在3A染色体上检测到一个控制成穗的QTL，且该QTL同时控制株高和穗粒数，为一因多效QTL。迄今，国内外研究者使用不同的小麦群体，将控制小麦分蘖成穗的QTL定位在1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4D、5A、5D、6D、7A和7B等多个染色体上，并开发出较多的分子标记[12-18]。但是这些与基因和QTL位点连锁的分子标记大多具有品种特异性，只在特定的环境或遗传背景下才有效，且多数并未实际应用到育种进程中。因此，这些已报道的分子标记在西南麦区的有效性和实用性有待进一步验证。目前，分子标记的有效性和实用性越来越受到育种家的关注。马 丽等[19]通过对7个已报道的小麦穗发芽抗性相关分子标记与表型的相关性研究，从中筛选出3个实用性好的分子标记。张兆萍等[20]选用4个小麦穗发芽抗性相关分子标记研究其与表型的相关性，筛选出2个可用于鉴定穗发芽抗性的分子标记。王金萍等[21]通过分析159份玉米自交系的分子标记验证结果和茎腐病田间表型的符合度，筛选出4个可用于抗茎腐病检测的分子标记。但是与小麦重要产量因素分蘖成穗相关的分子标记验证尚未见报道。本研究利用6个已发表的分子标记对以多穗型小麦品种川农18和新品系T1208构建的包含371个株系的重组自交系群体进行PCR扩增，验证其在该群体中的有效性，并评估其实用性，以期为西南麦区小麦优质育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 小麦材料及田间种植

供试材料为小麦品种川农18与新品系T1208构建的重组自交系(F11及F12)，包含371个株系，各株系农艺性状表型基本稳定，适合进一步研究。川农18的单位面积(每平方米，下同)最大分蘖数和穗数分别为450.33和341.67，T1208的单位面积最大分蘖数和穗数分别为404.67和277.00，以上数据为两年平均值。该群体于2014-2015年度和2015-2016年度种植在四川农业大学小麦育种基地(四川省邛崃市，30°25′N,103°28′E)。采用随机区组设计，小区行长2 m，每行20株，行距0.25 m，每个株系种植4行，3次重复。栽培管理同大田标准化管理方法。

1.2 分蘖成穗数的调查

播种85 d后调查最大分蘖数，播种157 d后调查穗数[22]。从每个小区第2行和第3行的固定位置选取20株调查最大分蘖数和穗数，3次重复的平均值作为每个株系最大分蘖数和穗数的表型值，然后计算单位面积(m2)最大分蘖数和穗数(观测值为每0.5 m2的最大分蘖数和穗数，乘以2得出单位面积最大分蘖数和穗数)。

1.3 基因组DNA的提取及PCR扩增

每个株系随机选取10粒种子进行发芽、栽培，于三叶期提取基因组DNA[23]。PCR反应体系为25 μL，包含2 μL(50 ng· μL-1)基因组DNA、2.5 μL 10× buffer(由天根生化科技有限公司生产)、0.5 μL 10×dNTPs(由上海博彩生物科技有限公司生产)、1 μL上下游引物(表1，由擎科梓熙生物技术有限公司合成)、0.2 μLTaq酶(5 U·μL-1，由天根生化科技有限公司生产)和17.8 μL ddH2O。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50～65 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35次循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在恒定功率55 W下分离约45 min后银染[24]，最后照相并统计带型。

表1 本研究所用的分蘖成穗相关分子标记Table 1 Molecular markers related to tiller number and spike number in the present study

1.4 数据统计分析

数据统计分析采用软件SPSS 22.0和Microsoft Excel 2016进行。等位基因与分蘖成穗相关性分析参照马 丽等[19]和张海萍等[25]的方法，即对等位基因进行赋值，将在某位点含有该等位基因的株系赋值为“1”，不含该等位基因的株系赋值为“0”，利用Pearson相关分析模型评价每个等位基因与单位面积最大分蘖数和穗数的相关性，进而验证分子标记的有效性。单位面积最大分蘖数和穗数均取两年平均值。

2 结果与分析

2.1 单位面积最大分蘖数和穗数及其相关性

通过田间调查和计算，371份供试材料的单位面积最大分蘖数为254.00～700.67，变异系数为22.28%；单位面积穗数为197.67～391.67，变异系数为14.12%。将单位面积最大分蘖数小于350定为低分蘖，350～500定为中分蘖，大于500定为高分蘖。371个株系中，低分蘖组有86个株系，中分蘖组有202个株系，高分蘖组有83个株系。将单位面积穗数小于250定为低成穗，250～300定为中成穗，大于300定为高成穗。371个株系中，低成穗组有54个株系，中成穗组有191个株系，高成穗组有126个株系。相关性分析结果表明，单位面积最大分蘖数与穗数极显著正相关，相关系数为0.792(P<0.001)。

2.2 分蘖成穗相关分子标记的有效性验证结果

2.2.1 分子标记Xgwm264的有效性

分子标记Xgwm264在371份供试材料中共扩增出四种类型的片段，其中，A型含有大小为180 bp和250 bp的2个条带；B型含有大小为120 bp和175 bp的2个条带；C型含有大小为150 bp左右的2个条带；D型含有大小为120 bp、180 bp和250 bp的3个条带(图1)。扩增出A型条带的材料共31份，占总数的8.36%；扩增出B型条带的材料共185份，占总数的49.87%；扩增出C型条带的材料共143份，占总数的38.54%；扩增出D型条带的材料共12份，占总数的3.23%。B和C分别为亲本T1208和川农18的带型。从与分蘖、穗数的相关性来看(表2)，扩增出A型条带的材料与分蘖、穗数无显著相关性；B型条带与分蘖数和穗数均呈极显著负相关；C型条带与分蘖数和穗数均呈极显著正相关；D型条带与分蘖数呈极显著正相关，但与穗数无显著相关性。说明能扩增出B型条带的材料单位面积最大分蘖数和穗数较低，能扩增出C型条带的材料单位面积最大分蘖数和穗数较高，该分子标记可用于供试材料分蘖数和穗数的筛选鉴定。

1～12为RIL群体的株系编号；A、B、C、D代表不同类型的扩增条带，其中，B和C分别为亲本T1208和川农18的带型。

1-12 represent tested lines of RILs;A,B,C and D represent the different types of the amplified bands,among which,B and C were the same as that amplified from the parents T1208 and Chuannong 18,respectively.

图1 分子标记Xgwm264扩增出的片段类型

*和**分别代表在0.05和0.01水平上显著相关。

* and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.2.2 分子标记Xbarc232的有效性

用分子标记Xbarc232在371份供试材料中共扩增出两种类型的片段，其中，A型不含有大小为175 bp的条带；B型含有大小为175 bp的条带(图2)。扩增出A型条带的材料共201份，占总数的54.18%；扩增出B型条带的材料共170份，占总数的45.82%。A和B分别为亲本T1208和川农18的带型。从与分蘖、穗数的相关性分析可以看出(表2)，A型条带和B型条带均与分蘖数和穗数无显著关系，说明该分子标记不适合用于分蘖成穗数的筛选鉴定。

1～9为RIL群体的株系编号；A和B代表不同类型的扩增条带，A和B也分别为亲本T1208和川农18的带型。

1-9 represent tested lines of RILs；A and B represent the different types of the amplified bands,which were the same as that amplified from the parents T1208 and Chuannong 18,respectively.

图2分子标记Xbarc232扩增出的片段类型

Fig.2PCRfragmentsamplifiedwiththemolecularmarkerXbarc232

2.2.3 分子标记Xwmc169的有效性

用分子标记Xwmc169在371份供试材料中共扩增出三种类型的片段，其中，A型不含有大小为150 bp和170 bp的条带；B型含有大小为150 bp的条带；C型含有大小为150 bp和170 bp的条带(图3)。扩增出A型条带的材料共66份，占总数的17.79%；扩增出B型条带的材料共269份，占总数的72.51%；扩增出C型条带的材料共36份，占总数的9.70%。A和B分别为亲本T1208和川农18的带型。从与分蘖、穗数的相关性分析可以看出(表2)，A型条带与分蘖数和穗数均呈极显著正相关；B型条带与分蘖数和穗数均呈极显著负相关；C型条带与分蘖数和穗数均无显著相关。说明能扩增出A型条带的材料单位面积最大分蘖数和穗数较高，能扩增出B型条带的材料单位面积最大分蘖数和穗数较低，该分子标记可用于供试材料分蘖数和穗数的筛选鉴定。

1～10为RIL群体的株系编号；A、B和C代表不同类型的扩增条带，其中，A和B分别为亲本T1208和川农18的带型。

1-10 represent tested lines of RILs；A，B and C represent the different types of the amplified bands,among which,A and B were the same as that amplified from the parents T1208 and Chuannong 18,respectively.

图3分子标记Xwmc169扩增出的片段类型

Fig.3PCRfragmentsamplifiedwiththemolecularmarkerXwmc169

2.2.4 分子标记Xwmc215的有效性

用分子标记Xwmc215在371份供试材料中共扩增出三种类型的片段，其中，A型含有大小为230 bp和375 bp的条带；B型含有大小为235 bp的条带，且不含有大小为375 bp和230 bp的条带；C型含有大小为230 bp和235 bp的条带(图4)。扩增出A型条带的材料共204份，占总数的54.99%；扩增出B型条带的材料共160份，占总数的43.13%；扩增出C型条带的材料共7份，占总数的1.88%。A和B分别为亲本T1208和川农18的带型。从与分蘖、穗数的相关性分析可以看出(表2)，能扩增出A型条带的材料与分蘖数呈极显著正相关，但与穗数无显著相关；B型条带与分蘖数呈极显著负相关，但与穗数无显著相关；C型条带与分蘖数和穗数均无显著相关。因此该分子标记仅可用于供试材料分蘖数的鉴定筛选。

1～7为RIL群体的株系编号；A、B和C代表不同类型的扩增条带，其中，A和B分别为亲本T1208和川农18的带型。

1-7 represent tested lines of RILs,A，B and C represent the different types of the amplified bands,among which,A and B were the same as that amplified from the parents T1208 and Chuannong 18,respectively.

图4分子标记Xwmc215扩增出的片段类型

Fig.4PCRfragmentsamplifiedwiththemolecularmarkerXwmc215

2.2.5 分子标记Xgwm437的有效性

用分子标记Xgwm437在371份供试材料中共扩增出五种类型的片段，其中，A型含有大小为130 bp和250 bp的条带；B型含有大小为190 bp和250 bp的条带；C型含有大小为210 bp和250 bp的条带；D型含有大小为130 bp的条带；E型含有大小为210 bp的条带(图5)。扩增出A型条带的材料共102份，占总数的27.49%；扩增出B型条带的材料共12份，占总数的3.23%；扩增出C型条带的材料共225份，占总数的60.65%；扩增出D型条带的材料共10份，占总数的2.70%；扩增出E型条带的材料共22份，占总数的5.93%。A和C分别为亲本T1208和川农18的带型。从与分蘖、穗数的相关性分析可以看出(表2)，A型条带与分蘖数呈极显著正相关，但与穗数无显著相关；B、C、D型条带与分蘖数和穗数均无显著相关；E型条带与分蘖数和穗数均呈极显著负相关。说明能扩增出A型条带的材料单位面积最大分蘖数较高，能扩增出E型条带的材料单位面积最大分蘖数较低，该标记可用于供试材料分蘖数的筛选鉴定。仅有E型条带与单位面积穗数具有相关性，因此该分子标记能否用于穗数的筛选鉴定还有待进一步验证。

2.2.6 分子标记Xcfd23的有效性

用分子标记 Xcfd23在371份供试材料中共扩增出三种类型片段，其中，A型含有大小100 bp的条带；B型含有大小125 bp的条带；C型含有大小为100 bp和125 bp的条带(图6)。扩增出A型条带的材料共136份，占总数的36.66%；扩增出B型条带的材料共14份，占总数的3.77%；扩增出C型条带的材料共221份，占总数的59.57%。A和C分别为亲本T1208和川农18的带型。从与分蘖、穗数的相关性来看(表2)，扩增出A型条带的材料与分蘖数呈极显著负相关，但与穗数无显著相关性；扩增出B型条带的材料与分蘖数无显著相关性，与穗数呈显著正相关；扩增出C型条带的材料与分蘖数呈极显著正相关，但与穗数无显著相关性。说明能扩增出A型条带的材料分蘖数较低，能扩增出C型条带的材料分蘖数较高，该标记可用于供试材料分蘖数的筛选鉴定。仅B型条带与穗数具有相关性，因此该分子标记能否用于穗数的筛选鉴定还有待进一步验证。

1～11为RIL群体株系编号；A、B、C、D和E代表不同类型的扩增条带，其中，A和C分别为亲本T1208和川农18的带型。

1-11 represent tested lines of RILs,A,B,C,D and E indicated different types of amplified bands,among which,A and C were the same as that amplified from the parents T1208 and Chuannong 18,respectively.

图5分子标记Xgwm437扩增出的片段类型

Fig.5PCRfragmentsamplifiedwiththemolecularmarkerXgwm437

1～10为RIL群体株系编号；A、B和C代表不同类型的扩增条带，其中，A和C分别为亲本T1208和川农18的带型。

1-10 represent tested lines of RILs,A,B and C indicated different types of amplified bands,among which,A and C were the same as that amplified from the parents T1208 and Chuannong 18,respectively.

图6分子标记Xcfd23扩增出的片段类型

Fig.6PCRfragmentsamplifiedwiththemolecularmarkerXcfd23

3 讨 论

3.1 单位面积最大分蘖数和穗数的相关性及多效性基因

高产是育种家们追求的主要目标，小麦单位面积穗数作为“产量三要素”之一，是非常重要的农艺性状，而单位面积最大分蘖数又直接决定了单位面积穗数。本研究中，单位面积最大分蘖数与单位面积穗数的相关性达到极显著水平(P<0.001)，这也与前人的研究结果相一致[15]。前人研究表明，小麦穗数的广义遗传力高达0.88，分蘖数的广义遗传力也达到0.63[2,26]。这说明通过育种手段，从品种本身提高分蘖数和穗数进而提高产量是非常有效的方法。单位面积最大分蘖数与单位面积穗数是一对具有显著相关性的性状，受到多效性基因的控制，Li等[15]报道了一个位于6D染色体同时控制分蘖数和穗数的一因多效QTL。多效性是基因较为常见的属性，在遗传、进化、衰老、发育和疾病等多个方面都有出现[26]。在育种进程中，具有多效性的基因往往更加有利于稳定化选择[27]。与多效性基因或QTL所连锁的分子标记具有更高的实际应用价值。本研究选取了6个与单位面积最大分蘖数或单位面积穗数相关的分子标记，在本课题组所构建的RIL群体中进行有效性验证，该群体来源于亲本多穗型小麦品种川农18和1BL/1RS新品系T1208，川农18具有较强的分蘖成穗力，其单位面积最大分蘖数和单位面积穗数均明显高于T1208。选用某一性状差异较大的两亲本所构建的群体，更有利于对该性状进行QTL定位，同样也更有利于分子标记的有效性验证[28]。

3.2 分子标记有效性验证的意义

小麦大量性状的QTL定位已见报道，但已报道的小麦QTL位点大多仅在一个或两个环境中被检测出，与QTL位点紧密连锁的分子标记则缺乏通用性。杨 燕等[29-30]在95份中国地方小麦品种和历史小麦品种中检测分子标记Xgwm155，发现其与穗发芽抗性相关，但在67份红粒春小麦中检测分子标记Xgwm155却与穗发芽抗性不相关。张兆萍等[20]在41份黄淮南片区试品系和309份国内外品种中检测分子标记Xgwm155，发现其与穗发芽抗性不相关。说明与基因和QTL位点相关的分子标记大多具有品种特异性，只在特定的环境或遗传背景下才有效，且多数分子标记并未实际应用到育种进程中。因此，若想将QTL定位结果和分子标记与实际育种相结合，那么对分子标记在某一特定环境及遗传群体中的有效性验证具有非常重要的意义。

3.3 分蘖与穗数相关分子标记的实用性

目前，小麦分子标记大多集中在遗传作图和QTL定位等基础环节，有关分蘖、穗数相关分子标记的有效性研究尚未见报道。经本研究相关分析表明，分子标记Xgwm264扩增出的B、C、D型条带，分子标记Xwmc169扩增出的A、B型条带，分子标记Xwmc215扩增出的A、B型条带，分子标记Xgwm437扩增出的A、E型条带以及分子标记Xcfd23扩增出的A、C型条带，均与单位面积最大分蘖数存在极显著相关性，其中，分子标记Xgwm264和Xwmc169所扩增出的条带，同时与单位面积穗数存在极显著相关性，且相关性非常一致。例如，分子标记Xwmc169扩增出的A型条带，同时与单位面积最大分蘖数和单位面积穗数呈极显著正相关，扩增出的B型条带则同时与其呈极显著负相关。说明这两个分子标记可能与多效性基因连锁，可同时用于筛选分蘖数和穗数，具有较高的应用价值。其中，分子标记Xgwm264的等位基因与单位面积最大分蘖数和单位面积穗数的相关系数更高，用于西南麦区育种的准确性更高。分子标记Xwmc215、Xgwm437和Xcfd23扩增出的条带仅可用于分蘖数的筛选，具有一定的应用价值。分子标记Xbarc232的等位基因与单位面积最大分蘖数和单位面积穗数相关性不显著，这与汤颖子[28]的研究结果不一致，其研究表明分子标记Xbarc232与单株最高分蘖数和成穗数呈显著正相关，相关系数分别为0.402和0.299。究其原因可能是研究方法的不同，本研究着重剖析每一种等位基因类型与单位面积最大分蘖数和单位面积穗数的相关性，再通过其相关性确定该分子标记的实用性；同时，由于数量性状明显受到环境的影响，因田间数据来源于不同年份，导致不一致的结果。因此，分子标记Xbarc232是否适用于分蘖、成穗数的筛选有待进一步验证。

4 结 论

分子标记Xgwm264和Xwmc169与由多穗型小麦品种川农18和1BL/1RS易位新品系T1208构建的RIL群体的单位面积最大分蘖数和单位面积穗数具有极显著相关性，将其用于分蘖成穗数的筛选，可得到具有较高分蘖成穗力的小麦品种(系)，为西南麦区高产育种提供理论依据和参考信息。

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