一步成形法制备单细胞培养芯片

叶芳, 何美莹, 谢晋, 谢丽, 常洪龙, 苑伟政

1．西北工业大学机电学院，陕西西安710072;2．空天微纳系统教育部重点实验室，陕西西安710072;3．中国工程物理研究院电子工程研究所，四川绵阳621000;4．西北工业大学生命学院，陕西西安710072;5．空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室，陕西西安710072

细胞是构成有机体的基本单位，针对单细胞的研究对于有机体的生长发育、遗传信息的传递、以及组织工程、再生医学等，有着至关重要的作用。在单细胞层面研究细胞样品时，细胞的实际响应，特别是细胞的一些微弱响应，可以实现准确表征[1]。在传统的细胞生物学研究中，以培养皿为培养工具，得到的数据为组群的平均值，无法满足单细胞研究的需要。随着微机电系统(MEMS)技术的出现，使得单细胞培养成为可能。细胞定位培养是目前MEMS技术应用于细胞研究的核心内容之一。其基本出发点是将所研究的细胞限制在特定的空间位置上，从而在某种水平上实现人们控制细胞生长，甚至以单细胞为研究对象的愿望。由于定位培养芯片能够控制细胞的位置，因此被认为是理解细胞功能的强有力工具。

目前应用比较多的一类实现单细胞培养的方法是化学表面修饰，即在芯片表面上形成促进细胞粘附的“亲细胞”区域和抑制细胞粘附的“斥细胞”区域。细胞定位培养效果主要取决于芯片表面化学材料薄膜所形成图形的质量。微接触压印技术(microcontact printing，μCP)是使用较为广泛的一类化学表面修饰方法[2-3]，微接触压印的过程类似于盖章的过程，所不同的是它由表面具有凹凸图形的弹性模具充当“印章”，用具有自组装性质的高分子化合物、蛋白质、凝胶等充当“印泥”[4]。由于在压印时施力的方向和大小难以精确控制，实验过程受人为因素影响较多，导致实验的可重复性降低。为解决该问题，人们采用毛细微模塑技术(micromolding in capillary，MIMIC)制备单细胞培养芯片：带沟槽的聚二甲基硅氧烷(poly-dimethylsiloxane，PDMS)模板与基底贴合形成微通道，再将填充液体置于微通道的入口处，液体在毛细力的作用下自发地填充微通道，待液态填充物干燥或固化后，将PDMS模版移去，即可得到微图形。与微接触压印技术相比，该方法的优点是在填充液体确定的情况下，溶液的填充效果一致性较好，片间差异小；对于实验操作人员的相关经验要求较少，成本较低。韩国忠南大学的Lee教授等人以聚电解质(polyelectrolyte，PEL)为芯片基底，分别采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)/聚丙交酯(polylactide，PLA)、琼脂糖作为填充材料，制备得到包含PEG/PEL[5]和琼脂糖/ PEL[6]的“亲细胞”/“斥细胞”图形交替细胞定位培养芯片。基底材料需要将聚烯丙基胺盐酸盐 (polyallylamine hydrochloride，PAH)和聚苯乙烯磺酸盐铵盐(polystyrene sulfonate ammonium salt，PSS)2种材料依次包被PEL表面，因而制备过程复杂。德国洛约拉马利蒙特大学的Radler教授等人[7]制备出聚乙二醇/聚苯乙烯(polyethylene glycol-Polystyrene，PEG/PS)细胞定位培养芯片，由于聚乙二醇需要进行紫外固化处理，造成工艺复杂，图形质量难以保证，细胞定位率降低。

针对以上问题，本文提出采用抑制细胞粘附的材料——聚甲基丙烯酸2-羟乙酯(Poly 2-hydroxyethyl methacrylate，PolyHEMA)与MIMIC技术相结合制备PolyHEMA/玻璃单细胞定位培养芯片。采用玻璃作为基底亲细胞材料结合PolyHEMA的斥细胞材料，这些商业化材料容易获得且使用广泛，芯片制备一步成形，大大减小了由于制备工艺复杂造成的片间差异，提高了后续实验的可重复性。本文拟在对毛细理论进行分析的基础上，着重研究图形完整性和稳定性影响因素，最终得到定位效果良好的单细胞培养芯片。

1 材料与方法

图1所示为一步成形法制备的单细胞培养芯片结构示意图。其中的“亲细胞”区域为玻璃，“斥细胞”区域为利用毛细微模塑技术制备的PolyHEMA图形。本文将着重围绕决定PolyHEMA微图形质量的关键因素——微图形尺寸以及图形的完整性和稳定性等方面进行讨论。

图1 PolyHEMA-玻璃单细胞定位培养芯片结构示意图

1.1 PolyHEMA微图形设计

PolyHEMA的化学式为(C6H10O3)n，溶于乙醇，饱和溶解度为120 mg/mL。它在强酸(或强碱)的条件下，可以发生水解反应，生成链状羧酸(或羧酸盐)和乙二醇。而培养液的PH值为7.2～7.4，其中的主要物质是氨基酸，既含有羧基(呈弱酸性)又含有氨基(呈弱碱性)，因此，PolyHEMA在细胞定位培养液中，不会发生水解反应而变质。PolyHEMA常温下是一种白色粉末状的高分子聚合物，具有溶胀性和良好的生物兼容性，PolyHEMA水凝胶可以用于制作隐形眼镜和三维支架等。在常规细胞培养板表面包被一定厚度的PolyHEMA，相比于未包被的细胞培养板，细胞的铺展面积变小，粘附性变差[8]，表明PolyHEMA具有抑制细胞粘附的特性。

采用化学修饰实现细胞定位培养的关键在于“亲细胞”/“斥细胞”图形的质量。为了得到高质量的连续图形，将带有凹槽结构的PDMS贴附在玻璃共同构成微米级毛细通道。当液体被施加到通道入口时，将自发地沿着通道流动，这种现象可以用固-液-气界面系统的能量转换来解释。在界面上，总的界面系统能量表示如下：

UT=Aslγsl+Asaγsa+Alaγla(1)

式中,Asl,Asa,Ala是固-液,固-气和液-气的面积;γsl,γsa,γla是相对应的单位表面自由能。

根据Young方程,表面自由能有以下的关系:

γsa=γsl+γlacosθc(2)

式中,θc是液体的平衡接触角;U0是常数。

系统总的自由能是引入液体体积的函数。弯曲液面的附加压强由下式给出:

(3)

当P是正值时,毛细驱动压力将推动液体向前流动;而当P是负值时,毛细驱动压力将阻止液体流动。在矩形微通道中,液-气界面的毛细驱动压力P[9,10]可由方程(3)来推导,得:

在此之后对退火样品与未经退火处理的样品分别进行了XRD表征，如图2所示将样品的特征峰与JCPDS (#33- 0040)标准卡片比对，经过磁控溅射法制备的薄膜样品在经过高温退火处理之后可以明显的看到所要制备的YAG晶向。

(4)

式中,γ是液体的表面张力;θb,θt,θl,θr是液体在微通道底壁、顶壁、左壁和右壁各自的静态接触角,θl=θr=θt=θPDMS;h和w是微通道截面的高度和宽度。

若侧面静态接触角小于90°, 即0°<θPDMS<90°,矩形截面的PDMS-玻璃微通道发生毛细填充的条件是:

(5)

若侧面静态接触角大于90° 即θPDMS>90°,矩形截面的PDMS-玻璃微通道发生毛细填充的条件是:

(6)

根据Takashi等人的研究数据可知,以乙醇作为填充溶液时, PDMS表面的乙醇接触角为25°[11],玻璃表面乙醇接触角接近0°。侧壁静态接触角,即PDMS的乙醇接触角,小于90°,将具体数值代入公式(6),得

(7)

(7)式的计算结果说明,乙醇填充PDMS-玻璃微通道时,毛细微通道的宽高比不影响毛细作用。但是,PolyHEMA乙醇溶液不同于纯乙醇,参考邓永波等人的研究[12],为了得到理想的毛细填充效果,将微通道的高度和宽度比限制在1以内。本文选取宽高比为0.25进行研究。

2.2 细胞培养芯片制备工艺设计

本文采用标准电感耦合等离子体刻蚀(inductively coupled plasma etch,ICP刻蚀)制备具有图案的硅模板,制备工艺如图2a)所示。利用复制模塑技术将硅模板上的图案转移至PDMS上,形成PDMS模板。如图2b)所示,将分割好的PDMS模板有微图案的一面轻轻放置在准备好的玻璃片上,静置一段时间以使两表面之间的气体排出,形成用于毛细填充的微通道。用微量移液器吸取一定量填充物溶液,滴加在微通道入口处,在毛细力的作用下,溶液会自发的快速填充微通道。待乙醇从PolyHEMA/乙醇溶液中完全挥发,在微通道中留下固态的PolyHEMA,剥离PDMS模板后得到芯片。

图2 芯片制备工艺流程图

2.3 图形完整性研究

细胞定位效果取决于图形对细胞的规约能力,而良好的规约能力依赖于图形的完整性。图形完整性要求尽可能小的图形漂移以及尽可能小的图形畸变[13]。本文将从填充溶液浓度以及微通道尺寸两方面研究图形的完整性。

完整、连续的微图形需要合理的微通道尺寸。为此本文研究了毛细填充的长度与微通道尺寸的关系,即毛细填充的动力学特性。

本文涉及的毛细微模塑过程为水平毛细填充,填充液体的重力及惯性力对液体在毛细管内的流动几乎不起作用,而液体的毛细驱动力和黏性阻力对液体的流动起到支配作用,所以参照竖直毛细现象的3个上升阶段的划分,水平毛细流动属于稳定的层流流动,所以采用描述圆管内黏性不可压缩流体的定常层流流动的Hagen-Poiseuille方程来计算液体的前进速率和填充长度[15]。其中,液体的前进速率可表示为:

(8)

式中,∑P是总有效驱动压力,包括非平衡大气压PA(PA=0)、静水压力Ph(Ph=0)和毛细压力PC(PC=2γcosθ/R)/Pa;η是液体的黏度/Pa·s;R是圆管半径/m,若为矩形截面,则等效半径R=bh/(b+h);l是圆管内液体已填充长度/m;θ是静态接触角,与壁面材料相关/°;ε是速度滑移系数。

可以看出,当壁面材料不同时,毛细通道内液体的前进速率和填充长度都有所不同,但是毛细通道内液体的前进速率均与毛细通道的等效半径正相关,与已填充长度负相关;液体的填充长度均与毛细通道的等效半径正相关。

2.4 图形稳定性研究

由于体外细胞培养是通过培养基这种液体环境,使细胞从中得到生长、增殖所需的氨基酸、维生素、糖类等营养物质,所以PolyHEMA微结构将在37℃的培养基中浸泡48 h以上。能否在培养液中继续维持良好的PolyHEMA图形形状对于保持图形抗细胞粘附能力,从而保证细胞定位培养的成功至关重要。

由于PolyHEMA具有溶胀特性,因此PolyHEMA薄膜厚度是决定图形稳定性的重要因素之一。结合所选取的细胞研究对象,确定微井尺寸为50 μm;结合2.1小节的分析结果,确定微通道的深宽比为0.25,设计3组芯片通道尺寸(如表1所示)进行稳定性实验:利用细胞培养液进行浸泡实验,相同时间间隔记录细胞定位培养芯片图形的尺寸,对比不同PolyHEMA薄膜厚度下图形失真的情况。

表1 稳定性实验所采用的微通道结构参数 单位：μm

PolyHEMA图形与基底表面之间结合的强度是决定图形稳定性的另一个重要因素。针对基底材料的表面预处理可以增加PolyHEMA与基底间的结合强度。本文采用玻璃表面的亲水处理进行表面改性,即采用铬酸洗液浸泡玻璃基底24 h以上,然后将基底改性前与改性后的芯片分别进行浸泡实验,以对比改性效果。

图形形状对于图形稳定性同样重要。正方形的微井4个尖角处由于尺寸突变,存在应力集中现象,所以当细胞培养时间较长时,变形量较大的是尖角处,容易导致图形的失效。宏观机械中改善应力集中的措施包括避免尖角(尖角被圆角或过渡圆角代替)、改善零件外形(曲率半径逐步变化的外形)等。为了改善微图形尖角的应力集中现象,本文选用避免尖角的方法。PolyHEMA图形形状的设计如图3所示,圆角不断变大(R=0 μm;R=5 μm;R=10 μm;R=15 μm;R=20 μm;R=25 μm),正方形逐渐被圆形代替,制备得到芯片后,采用细胞培养液浸泡的方式研究长期培养的细胞定位培养芯片图形的稳定性。

图3 研究PolyHEMA图形形状对图形稳定性影响的芯片图形设计

2.5 芯片性能细胞培养实验验证

为了验证芯片图形对细胞的规约能力,采用贴壁生长的小鼠成骨细胞MC3T3-E1来进行细胞实验,将细胞在芯片上培养48 h并进行固定和免疫荧光染色。

小鼠成骨细胞在含有10%胎牛血清(四季青)、1%青霉素-链霉素混合溶液(invitrogn)1%谷氨酰胺溶液的α-MEM培养基(hyclone)于37℃、5%CO2的培养箱中培养。消化细胞采用0.25%胰蛋白酶(invitrogn)约3 min,使用离心机在1 000 r/min,10 min收集细胞。细胞接种前采用60Co灭菌并且在三蒸水中浸泡24 h以上。将细胞接种芯片样品中。在恒温培养箱中培养48 h后,用显微镜观察并记录细胞生长状态。

采用4%多聚甲醛固定细胞20 min。0.1%Triton X-100穿孔以提高细胞通透性。加入鬼笔环肽-FITC(5mg/ml,sigma),使用Hoechst33258(2 mg/ml,sigma)复染细胞核。使用荧光倒置显微镜观察并拍摄照片,并利用Image Pro Plus进行数据处理。

3 结果与讨论

3.1 填充溶液浓度对图形完整性的影响

Shim 等人[11]的研究证实,6.5×10-3Pa·s(25℃)PEG-DMA溶液由于低黏度能快速挤出微通道内的空气,完成毛细填充。本文采用旋柱法测得室温(25℃)条件下,浓度为50 mg/mL的PolyHEMA乙醇溶液黏度为2.1×10-3Pa·s,浓度为70 mg/mL的PolyHEMA乙醇溶液黏度为6.6×10-3Pa·s。参考Shim等人的研究结果可知,50 mg/mL的PolyHEMA乙醇溶液的黏度相比于PEG-DMA溶液的6.5×10-3Pa·s,溶液黏度较小,故毛细填充的速率更快,更易实现毛细通道的完整填充。

PolyHEMA膜厚越厚,越有利于图形的稳定以及抑制细胞的粘附[16]。在50 mg/mL,70 mg/mL,90 mg/mL 3种浓度的对比实验中,浓度的变化引起PolyHEMA微结构厚度的变化,实验结果如图4所示。

图4 PolyHEMA/乙醇溶液浓度对微结构厚度(μm)的影响

综合考虑溶液黏度和膜厚2个方面,确定50 mg/mL作为毛细填充的最佳浓度。

3.2 基底材料表面预处理对图形稳定性的影响

对比了玻璃基底表面经亲水处理和不经亲水处理2种情况下,未在细胞培养液中浸泡和浸泡48 h后的PolyHEMA图形的差异,结果如图5所示。

图5 玻璃表面亲水处理对图形稳定性的影响

尺寸变化ABΔamax-0．1519(正方形)-0．1847(正方形)Δamin-0．02876(圆角R=20μm)-0．07162(圆角R=15μm)

注: A为玻璃表面亲水处理;B为玻璃未表面处理;Δa为微井尺寸变化率。

表2所示为取点测量计算后得到的PolyHEMA图形尺寸变化的最大值和最小值。显然,在浸泡相同时间后,经过亲水处理的细胞定位培养芯片图形损失小于未经表面处理的芯片。

因此,玻璃表面进行亲水处理可以提高细胞定位培养芯片图形的稳定性。

3.3 图形形状对稳定性的影响

将芯片在细胞培养液中浸泡48 h后,图形尺寸变化如表3所示。

表3 PolyHEMA图形形状对图形稳定性

其中,A为每3个圆角相同的为1组,共6组;B为每6个圆角连续变化的图形为1组;Δa为微井尺寸变化率。

相同条件下,芯片浸泡48 h后,各种形状均有不同程度的缩小,其中正方形的图形尺寸变化率最大,而圆角的变化对图形质量的影响没有一定的变化规律,但是圆形的图形尺寸变化率都小于正方形的图形尺寸变化率,所以可以通过尖角变圆角的方式提高细胞定位培养芯片图形稳定性。

3.4 细胞定位性能验证

以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为研究对象进行了48 h的细胞培养实验,结果如图6所示。

图6 细胞定位培养效果

从图中可以很直观地看到,绝大多数细胞都被限定在芯片上的特定位点:没有被PolyHEMA溶液填充而露出的玻璃表面。表明本文提出的一步成形法制备的单细胞培养芯片能够满足常规单细胞研究对细胞定位效果的要求。

研究同时发现,恰当的单细胞定位培养区域尺寸能够得到较高的细胞定位率。当定位培养区域尺寸不低于悬浮状态细胞尺寸时,培养区域尺寸越小,单细胞率越高;但是,细胞贴壁后必须要有足够的铺展空间,否则会导致细胞死亡,不能实现长期培养[17]。解决单细胞率与长期培养的矛盾,需要充分考虑所研究细胞本身的尺寸。图7所示为培养区域尺寸不同时,小鼠成骨细胞的粘附情况统计结果。定义“细胞定位率”为粘附细胞的培养区域个数与所有定位培养区域个数的比值,“单细胞定位率”为仅粘附单个细胞的培养区域个数与所有定位培养区域个数的比值。当定位培养区域尺寸从30 μm逐渐增大到60 μm,细胞定位率从85.2%,95.1%,97.5%逐渐增大到100%,而单细胞定位率从55.6%,14.8%,3.7%逐渐减小到0%;当定位培养区域尺寸为30 μm时,单细胞定位率最高可以达到55.6%。

图7 细胞定位培养区域尺寸与细胞定位率的关系

4 结 论

本文将毛细微模塑技术与抑制细胞粘附的化学材料PolyHEMA相结合,提出了一步成形制备单细胞定位培养芯片的新技术,并从保证图形的稳定性与完整性两方面出发,研究了溶液浓度、PolyHEMA图形薄膜厚度、基底材料预处理方法以及图形结构等因素对图形质量的影响,最终制备得到了图形质量可靠的单细胞培养芯片。芯片性能验证结果表明,50 mg/ml的PolyHEMA/乙醇溶液可以保证浸泡72 h以上图形的完整性;表面亲水处理后的玻璃片表面当PolyHEMA薄膜厚度为0.4 μm且采用圆角图形时,可以保证浸泡72 h以上的图形稳定性。高质量的图形使得细胞定位效果良好,完全能够满足常规细胞实验的生长要求。

[1] Di Carlo D, Tse H T K, Gossett D R. Introduction: Why Analyze Single Cells[M]. New York, Single-Cell Analysis Humana Press, 2012: 1-10

[2] Rape A D, Guo W, Wang Y. The Regulation of Traction Force in Relation to Cell Shape and Focal Adhesions[J]. Biomaterials, 2011, 32(8): 2043-2051

[3] Rodríguez-Hernández J, Cortajarena A L. Design of Polymeric Platforms for Selective Biorecognition[M]. Berlin, Springer, 2015

[4] Keenan T M, Folch A. Biomolecular Gradients in Cell Culture Systems[J]. Lab on a Chip, 2008, 8(1): 34-57

[5] Lee J H, Kim H E, Im J H, et al. Preparation of Orthogonally Functionalized Surface Using Micromolding in Capillaries Technique for the Control of Cellular Adhesion[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2008, 64(1): 126-134

[6] Jeong H H, Lee J H, Noh Y M, et al. Generation of Uniform Agarose Microwells for Cell Patterning by Micromolding in Capillaries[J]. Macromolecular Research, 2013, 21(5): 534-540

[7] Marel A K, Rappl S, Piera Alberola A, et al. Arraying Cell Cultures Using PEG-DMA Micromolding in Standard Culture Dishes[J]. Macromolecular Bioscience, 2013, 13(5): 595-602

[8] 司徒镇强,吴军正. 细胞培养[M]2版. 上海：世界图书出版公司, 2007

Situ Zhenqiang, Wu Junzheng. Cell Culture[M]2nd Ed. Shanghai, World Publishing Corporation, 2007 (in Chinese)

[9] 林炳承. 毛细管电泳导论[M]. 北京：科学出版社, 1996

Lin Bingcheng. Introduction of Capillary Electrophoresis[M]. Beijing, Science Press, 1996 (in Chinese)

[10] Jokinen V, Franssila S. Capillarity in Microfluidic Channels with Hydrophilic and Hydrophobic Walls[J]. Microfluidics and Nanofluidics, 2008, 5(4): 443-448 (in Chinese)

[11] Miyata T, Nakanishi Y, Uragami T. Ethanol Permselectivity of Poly(Dimethylsiloxane) Membranes Controlled by Simple Surface Modifications Using Polymer Additives[J]. Macromolecules, 1997, 30(18): 5563-5565

[12] 邓永波, 张平, 杜新, 等. 亲/疏水性不同壁面组成微通道的深宽比与通道内液体的自发毛细流动[J]. 光学精密工程, 2010, 18(7): 1562

Deng Yongbo, Zhang Ping, Du Xin, et al. Aspect Ratio for Micro-Channels with Nonuniform Surface Properties and Spontaneous Capillary[J]. Optics and Precision Engineering, 2010, 18(7): 1562 (in Chinese)

[13] 曾庆光, 侯永生, 张丽婴,等. 外延生长工艺条件对图形完整性的影响[C]∥上海市有色金属学会、上海市金属学会半导体材料专委会学术年会. 2004

Zeng Qingguang, Hou Yongsheng, Zhang Liying. et al. The Effects of Epitaxy Process on the Pattern Integrity[C]∥Annual Conference on Semiconductor Materials of the Shanghai Society of Metals, 2004 (in Chinese)

[14] Kim E, Xia Y, Whitesides G M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science[J]. Journal of the American Chemical Society, 1996, 118(24): 5722-5731

[15] 杜新,张平,刘永顺,等. 基于PDMS和玻璃材料的毛细管被动阀临界压力分析[J]. 光学精密工程, 2011(8): 1852-1858

Du Xin, Zhang Ping, Liu Yongshun, et al. Burst Pressure of Capillary Burst Valve Based on Glass and PDMS[J]. Optics and Precision Engineering, 2011(8): 1852-1858 (in Chinese)

[16] Fang Y, Jin J, Chang H, et al. Improved Single-Cell Culture Achieved Using Micromolding in Capillaries Technology Coupled with Poly(HEMA)[J]. Biomicrofluidics, 2015, 9(4):044106

[17] Chen C S, Mrksich M, Huang S, et al. Geometric control of Cell Life and Death[J]. Science, 1997, 276(5317): 1425-1428