脊髓小胶质细胞调控神经病理性疼痛的分子机制及中医药干预的研究进展

曹人郦，袁 蓓，顾艳丽，张立石，王 超，何海军，林 娜

(1中国中医科学院中药研究所,北京100700；2内蒙古医科大学,内蒙古呼和浩特010110；3中国中医科学院中医基础理论研究所,北京100700；4中国中医科学院望京医院,北京100102)

0 引言

神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛,主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏、痛觉超敏、感觉异常及情感障碍等［1］。NP发病机制复杂,既往研究多从神经元角度阐释NP病理机制,研究表明,NP发病机制与神经元G蛋白偶联受体、离子通道受体、细胞因子受体等激活介导的周围敏化相关,亦与炎症因子、细胞因子等介导的中枢敏化相关,主要表现为兴奋性突触传递增强和抑制性突触传递减弱［2－5］。NP临床治疗十分棘手,目前,阿片类药物或三环类抗抑郁药等均以抑制神经冲动为目的,并未针对病因或某个病理阶段特异性靶点进行干预,且常伴随严重的中枢副作用［6］。近年发现,中枢神经系统,特别是脊髓水平的小胶质细胞可通过直接连接、突触连接或释放神经递质影响神经元功能,并通过长时程增强作用(long-term potentiation,LTP)参与 NP 病理［7］,在 NP 发生、发展中发挥重要作用,并为NP治疗提供了可能的靶点。本文基于动物实验研究归纳了近年来脊髓水平小胶质细胞调节NP的分子机制及中医药干预NP作用机制的研究进展,期望为 NP的治疗及科学研究提供参考。

1 脊髓小胶质细胞参与神经病理性疼痛

小胶质细胞是中枢神经系统的免疫活性细胞,相当于周围组织的巨噬细胞,正常静息状态下处于稳定状态,并有支持、连接、保护及营养神经元的作用,但受损伤刺激后的小胶质细胞会迅速对神经损伤做出反应［1,8］,并表达多种标志性蛋白,启动细胞内相关信号通路,进而释放炎症介质导致神经功能的紊乱。

1.1 小胶质细胞活化因子及受体 神经元释放趋化因子、核苷酸、促炎因子等均可通过相应受体激活小胶质细胞。如,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、高迁移率族蛋白-1(high mobility group box protein 1,HMGB1)、神经调节蛋白1(neuregulin 1,NRG1)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、趋化因子 2(chemokine C-C motif ligand 2,CCL2)、趋化因子Fractalkine(Fractalkine,FK)等。

ATP可通过损伤相关分子模式(danger/damageassociated molecular patterns,DAMPs)活化嘌呤离子通道型受体(purinergic receptor),如P2X4R、P2X7R而激活小胶质细胞,相关受体拮抗剂能缓解NP模型动物低痛敏状态［9－10］；HMGB1可通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),如,Toll样受体2、4(toll-like receptors 2/4,TLR2/4)及糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)活化小胶质细胞,而抑制HMGB1介导的信号通路能缓解小胶质细胞介导的神经炎症［11］；NRG1与受体酪氨酸蛋白激酶ErbB(receptor tyrosine-protein kinase erbB)2,3,4结合可通过有丝分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)促进小胶质细胞活化［12－13］；神经损伤还能促进MMP-9表达介导小胶质细胞参与的神经炎症［14－15］；CCL2 也能通过趋化因子 2 受体(CC-chemokine receptor 2,CCR2)活化小胶质细胞,CCL2/CCR2介导的信号通路在NP痛敏维持中发挥重要作用,研究表明,CCR2基因敲除动物NP痛敏明显降低,CCR2 拮抗剂能有效提高动物痛敏阈值［16－17］；FK位于神经元表面,其受体为CX3CR1(CX3C-chemokine receptor 1,CX3CR1),被组织蛋白酶S(Cathepsin S,CatS)裂解的FK,不仅能增加神经元的兴奋性,还能通过FK/CX3CR1信号通路促进小胶质细胞活化继而诱导神经炎症反应［18］。

其他类型的受体还有神经递质受体,如,谷氨酸受体,γ-氨基丁酸受体,胆碱能受体,肾上腺素受体,多巴胺受体等［19］；激素受体及调节器受体包括组织胺受体,阿片受体,大麻素受体,P物质受体,神经营养因子受体,其他类型的趋化因子受体,白介素受体,干扰素受体等,均能通过相应配体参与小胶质细胞活化［20－23］。

1.2 小胶质细胞活化后的信号通路 小胶质细胞活化以细胞内相关信号通路激活及分泌相关炎性介质为主要表现,进而影响突触传递和神经元的兴奋性,其活化主要和以下信号通路相关：有丝分裂原活化激酶(mitogen activated kinase,MAPK)信号通路,核因子 κB(nuclear factor κB,NF-κB)信号通路,蛋白质酪氨酸激酶/转录活化子3(Janus tyrosine kinase/transducer and activator of transcription 3,JAK/STAT3)信号通路及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶Akt(Phosphoinositide 3-kinase/protein Akt kinase,PI3K/Akt)信号通路。

1.2.1 MAPK信号通路 MAPK信号通路包括ERK,p38 MAPK,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)介导的信号通路［24－27］。 研究发现,神经损伤可诱导小胶质细胞p38磷酸化,但星形胶质细胞和神经元中无明显p38磷酸化现象［28］,白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)可以促进 p38磷酸化,表明IL-1β参与p38上游机制［29-32］,p38抑制剂能提高 NP 动物痛敏阈值［33－34］。 ERK1/2磷酸化与 NP 痛敏改变密切相关,神经损伤可诱导ERK在小胶质细胞、星形胶质细胞及神经元中时序性改变,研究表明,ERK信号通路活化能调控蛋白酶活性并产生多种细胞因子,如,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),IL-1β 等参与 NP 痛敏的产生［35－37］。JNK主要存在于星形胶质细胞,研究发现,使用JNK抑制剂D-JNKI-1JNK可以提高NP动物机械痛敏阈值［38］；体外研究显示,星形胶质细胞活化与JNK信号通路密切相关,并能诱导单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的分泌［39］。 而最近研究显示,坐骨神经慢性压迫损伤(chronic constriction injury,CCI)模型中,小胶质细胞内JNK信号通路也会被激活,并且在第七天达到峰值［40］。

1.2.2 NF-κB信号通路 NF-κB是在B淋巴细胞中发现的一种核转录因子,参与多种细胞因子的调控。NF-κB 有 5 种亚型：p50,p52,p65,c-Rel和 Rel-B［41］。在神经系统中,NF-κB仅以p50或p65两种亚型存在［42］。NF-κB主要通过经典途径和非经典途径通路调控炎症反应,其中,细胞因子受体及Toll样受体参与的经典途径与NP病理密切相关［43－44］。研究发现,抑制胶质细胞NF-κB信号通路可通过NP动物模型痛敏阈值,并促进IL-6和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达［45］。

1.2.3 JAK/STAT3信号通路 JAK/STAT3信号通路主要参与细胞转导［46］,细胞因子,如,IL-6,γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、IL-10 与其受体结合能诱导JAK活化,进而迅速诱导STAT磷酸化而发挥转录功能。研究表明,STAT3在小胶质细胞活化过程中发挥重要作用［47］,如,STAT3能下调脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的小胶质细胞炎症因子(如iNOS,IL-6,CCL5 等)的释放［48］；IL-6 诱导 JAK/STAT3信号通路活化也能促进 iNOS、IL-18、TNF-α和CCL2等因子的释放［49］；研究还表明,STAT3能调控细胞生长和分化,JAK/STAT3信号通路不仅与小胶质细胞增殖相关,还参与小胶质细胞极化过程［49］。

1.2.4 PI3K/Akt信号通路 胰岛素及LPS可通过PI3K/Akt信号通路诱导小胶质细胞活化。PI3K/Akt信号通路与细胞生长、增殖、代谢等多种细胞功能相关。研究表明,PI3K可通过一系列转化激活Akt［49］,而Akt下游调节在NP病理中发挥重要作用,如,PI3K/Akt能调控突触可塑性和 LTP［50－52］。

1.3 小胶质细胞活化释放的炎症介质 小胶质细胞具有随周围环境变化向M1或M2型小胶质细胞转化的极化现象,用LPS刺激小胶质细胞能诱导其向M1型细胞转化释放促炎因子,如,IL-1β,IL-6,IL-12,IL-15,IL-18,IFN-γ,TNF-α,CCL2-5,CCL7,环氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)和 iNOS 等［53］；而用抗炎化合物如IL-4,IL-13等能诱导小胶质细胞向M2型细胞转化,使促炎表型失活,重建细胞自稳并诱导小胶质细胞分泌一系列镇痛因子,如,IL-1α、IL-1ra、IL-3、IL-10及组织型基质金属蛋白酶抑制因子-1,神经生长因子,转化生长因子-β等［54］。相关研究为从小胶质细胞极化角度治疗NP提供了思路。

1.4 小胶质细胞与其它细胞的相互作用 在NP病理演化的不同阶段,小胶质细胞还与神经元及其它细胞存在动态、复杂的相互作用关系,如,星形胶质细胞活化依赖于小胶质细胞激活,二者动态的相互作用介导了NP的启动和维持［55］；神经受损后,血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)上皮细胞黏附分子-1能促进小胶质细胞活化［56－57］；少突胶质细胞可释放 IL-33并通过IL-33/ST2途径激活小胶质细胞内 PI3K,MAPKs,NF-κB 信号通路［58－59］。 肥大细胞不仅脱颗粒敏化伤害性感受器,还能通过BBB及血脊髓屏障与小胶质细胞相互作用,研究表明,肥大细胞中的类胰蛋白酶能通过蛋白酶激活受体2信号通路促进小胶质细胞释放 TNF-a,IL-6［60］；神经损伤也能诱导CD4+－T淋巴细胞渗透到脊髓背角通过CatS/IFN-γ信号通路或CD40途径与小胶质细胞相互作用,并参与触诱发痛的形成［61－62］。

2 中医药单体以及复方对小胶质细胞的调控作用

中医药以中医理论为基础,辨证论治为原则,千百年来在干预慢性疼痛方面发挥了重要作用,中医药不仅重视疼痛症状,更依据疼痛产生的原因进行求本治疗［63－64］。研究表明,许多中药及复方有抑制NP小胶质细胞活化的作用。

早在公元前3世纪我国便有利用大麻缓解疼痛的记载,大麻的活性化合物大麻素2型受体--β-石竹烯能抑制小胶质细胞的活性,具有抗炎和镇痛作用［65－66］。雪上一支蒿中的一枝蒿甲素是二萜类生物碱,这种单体成分通过促进脊髓小胶质细胞分泌强啡肽 A 缓解中枢敏化作用［67］。 钩吻子素［68］,白藜芦醇［69］,蒿本内酯［70－71］都可以降低 LPS 诱导的原代小胶质细胞炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的产生,有效缓解NP痛觉过敏,研究认为,其抑制小胶质细胞激活和促炎细胞因子的产生为其抗炎和神经保护作用的关键。墨西哥鼠尾草中的鼠尾草提炼剂(salvinorin A)是一种非含氮的kappa阿片类药物受体激动剂,实验结果表明,SA可有效减少福尔马林诱导的机械性痛觉过敏及脊髓神经元的高兴奋性［72］。丹参的主要有效成分丹参酮IIA可以有效抑制脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)模型动物脊髓小胶质细胞活化,其机制与抑制MAPKs活化及减少TNF-α、IL-1β的表达相关［73］。虎杖提取物对CCI诱导的机械性痛觉过敏有显著的抑制作用,研究表明,其机制可能与抑制脊髓小胶质细胞ERK和p38的磷酸化相关［74］。黄芩中的黄芩苷可明显升高CCI大鼠术后的机械痛敏阈值,且其镇痛作用维持时间优于吗啡［75］。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种酚性色素,具有抗炎和抗氧化等多种药理作用,其可以通过下调IκB激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,Iκ-Bk)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的活性抑制NF-κB的激活及其调控的相关基因表达,而神经损伤诱发活化的NF-κB可通过上调脊髓CX3CR1表达参与NP的形成［76］。属于裂环环烯醚萜的莫诺苷可通过激动脊髓胰高血糖素样肽1受体(glucagonlikepeptide1,GLP-1)对 NP产生镇痛作用［77］。 异构体芍药苷［78］(isomers paeoniflorin,PF)和芍药内酯苷［79］(albiflorin,AF)是从芍药的根中提取的主要成分,研究表明PF和AF均可抑制脊髓小胶质细胞p38丝裂原活化蛋白激酶通路的激活并降低促炎细胞因子的表达。梓醇是从地黄根部提取的一种环烯醚萜类小分子化合物,研究表明,梓醇能通过调节TNF-α和AKT抑制NF-κB信号通路,进而抑制小胶质细胞激活,减少炎症因子的释放；中药材独一味也有相似的药效及作用机制［80－81］。

由当归、肉桂和葛根等组成的当归四逆汤的水提物组,广泛用于炎症和缺血性疾病的治疗,其治疗NP的机制可能与抑制脊髓小胶质细胞、星形胶质细胞活化及抑制炎症介质的表达相关,研究发现,当归四逆汤能通过抑制脊髓NF-κB活化和/或细胞因子表达有效缓解CCI和糖尿病神经病变［82］。中医药复方身痛逐瘀汤也可有效的缓解CCI大鼠的神经病理性疼痛痛觉过敏,改善大鼠患侧后肢运动功能,其机制可能与下调脊髓磷酸化p38蛋白表达有关［83］。

NP的其它治疗方法还包括理疗、针灸、介入手术等,如电针镇痛机制与抑制小胶质细胞p38 MAPK通路相关［84］。

NP发病机制复杂,疼痛相关信号调控原件功能又非单一,而目前NP治疗从技术上还达不到靶向病变细胞相关靶点进行特异性干预,所以,针对疼痛信号传导通路中某一靶点的干预必然伴随副作用,这也在阿片类药物、三环类抗抑郁药物、离子通道抑制剂等临床应用的副作用中得到证实［6］。基于NP发病机制复杂及目前广泛应用治疗NP的药物非证候考虑的情况,我们初步根据经典证候方剂-乌头汤及蒙药那如-3进行了病证结合动物模型的探索,课题组采用经典的腰5脊神经结扎模型探索NP的证候,从SNL模型小鼠尿液代谢、毛色变化及乌头汤、蒙药那如-3脊髓组织炎症因子的变化情况我们认为：SNL模型可模拟临床的“寒痹”、“冷痹”疼痛模型［63］。而病证结合的早期干预(乌头汤、蒙药那如-3)不仅能有效缓解实验动物的病情进展,还能抑制脊髓胶质细胞的活化和降低实验动物脊髓背角组织炎症因子的表达［85－86］；既往多认为炎症变化多与中医的热证密切相关,本研究为中医热证等同于“炎症因子”的认识提供了另一种解释：不同模型的炎症反应只是综合证候的一个方面,微观病理不能完全代表证候的综合表象。

基于中医药辨证及多靶点干预疾病的特点,我们采用不同慢性疼痛动物模型研究发现,乌头汤镇痛机制与抑制周围神经瞬时受体电位通道蛋白活性相关［87］；其主要成分-制川乌兼具激动脊髓内源性kappa受体及抑制瞬时受体电位通道蛋白V1活性的双重作用［88］；在SNL模型中,我们发现,乌头汤对小胶质细胞及星形胶质细胞具有多靶点的抑制效应,并在脊髓组织基因芯片结果中得到证实［85－86］,相关机制可能是间接发挥,但对NP病证结合的临床辨证干预可能具有借鉴和指导意义。

3 小结及展望

中枢敏化是NP的主要发病机制,既往多从神经元突触重塑角度阐述NP病理,近年发现小胶质细胞亦与NP中枢敏化密切相关,并与神经元、其他胶质细胞、淋巴细胞等存在动态、广泛、复杂的网络联系,共同参与了NP的发生、发展和维持。NP发病机制复杂,受伦理学限制及研究条件的限制,目前绝大多数研究多采用实验动物作为研究对象,且时有相互矛盾的结果,而人类小胶质细胞无论从结构和功能上均有差异于动物的复杂性,故目前的研究均存在不同程度的局限性,相关机制有待于进一步深入研究。如,在NP病理演化过程中,于体外研究或动物水平,虽然对小胶质细胞活化因子、小胶质细胞相关受体蛋白、小胶质细胞释放的炎症介质等有较深入的研究,但其时间、空间复杂的相互作用关系目前还未阐明；在不同刺激因子作用下,小胶质细胞可适应微环境变化表现出不同亚型或表型,而使得NP发病机制更加复杂,小胶质细胞极化可能为NP治疗提供了新的靶点及切入点,但受目前研究对象及技术手段的限制其相关研究还有待于进一步深入；再比如,小胶质细胞在NP病理演化过程中存在动态的、复杂的背景信号通路网络及相互关系,且特定的信号通路调控原件的功能也不是单一的,故针对某一个靶点的特异性干预可能伴随严重的副作用,这也是针对小胶质细胞特定靶点开发新药困难的原因。

目前,NP多靶点干预的治疗理念得到认同［63－64］,这也与中医药辨证论治综合干预慢性疼痛的理念不谋而合,中医药治疗慢性疼痛不仅重视疼痛或痛觉过敏症状,更重视引发疼痛的原因及综合证候表现,针灸、拔罐、按摩、药物敷贴、辨证用药等综合干预某些类型NP的有效性均得到临床验证。目前,NP的主要干预手段仍是药物治疗,还无特异性治疗神经损伤的中药或中成药,小胶质细胞为NP启动的“关卡”,并和周围其他细胞形成复杂的相互作用,从而成为重要的NP干预靶细胞,结合NP不同动物模型中小胶质细胞病理演化的微观辨证,可能有益于NP的临床有效干预及新药研发。基于既已验证的中医药多途径、多靶点抑制小胶质细胞神经炎症的事实,我们可以采用反向医学研究的方法,聚焦于NP发病的特定病因、业已证明的关键靶点、特定病理阶段点及证候特点,临床采用宏观辨证与微观辨证相结合的方法药物整体调节,促进机体证候的改善并关注神经炎症及损伤改善的关键点［89－90］,并在诱导性多功能干细胞分化的髓系前体细胞水平验证,进而从天然药物中筛选NP治疗的特异性药物,且必须关注整体证候,如针对特异性神经损伤,疼痛明显者可从“寒痹”角度进行研究验证；再如,糖尿病神经损伤单纯采用对症治疗的方法效果并不理想,根据中医络病理论,针对临床患者某一阶段的病理变化,采用补气活血,化瘀通络或清利湿热的方法筛选特定标志物,关注与小胶质细胞联系的关键点,结合体外诱导的人小胶质细胞水平的验证等,可能对特异性神经损伤的治疗具有标本兼治的作用。

总之,NP发病机制复杂,有待于进一步深入研究；小胶质细胞介导的神经炎症机制的发现为NP治疗提供了可能的靶点；针对不同病因、不同病理阶段,采用宏观辨证与微观辨证相结合的方法进行综合干预可能有益于NP的治疗；结合髓系前体细胞诱导人小胶质细胞体外培养技术及反向医学验证的思路,对特定病因、特定病理阶段的NP新药研发也可能具有一定的借鉴意义。