无血清培养基的研究进展

张松 ，乔自林 ，王家敏

（1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院）

血清组分的复杂性和不确定性及批次间的差异增加了疫苗等细胞产品生产及质量控制的难度，同时血清易引起细菌、真菌、病毒及支原体的污染，增加了疫苗生产的安全性隐患。并且血清本身价格也比较昂贵，这些均使得血清在生产和研究中的应用存在诸多不利。在培养基中添加血清对人们所造成的这些困扰，已经使得不论是科研人员还是工业生产企业对于无血清培养产生了强烈需求。有大量实践证明无血清培养基不仅能在很大程度上避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷，而且也能取得良好的培养效果。因此，无血清培养基得到了越来越广泛的应用。

1 血清培养基存在的问题

人类历史上第一次培养动物细胞时所用的添加物是动物血清（如新生牛血清、优级胎牛血清等，添加量一般在5%～15%之间)等天然的动物体液性补充物。这些天然的体液性补充物可以在较长的一段时间里维持细胞生长。它们主要是可以向培养细胞提供激素、生长因子、贴壁因子、结合蛋白和其它营养物质等。然而，尽管血清对细胞具有良好的生长促进作用，但使用血清作为培养基的添加剂依然存在很多问题。

1.1 高成本和可用性问题

血清作为培养基中的重要营养物质来源，血清可占总体成本的85%～90%。比如在新西兰等发达国家，其血清成本花费高达500~1000美元/L不等。另外，含血清培养基的可用性也各有不同，特别是对于那些关注动物福利的国家，当地居民对杀害动物获得血清的行为极其抵制。

1.2 伦理问题

从牛胎儿中获得血清引起了国际社会对动物福利的关注，如对实验动物造成伤害，存在着道德和伦理上的问题［1］。

1.3 血清批间差异问题

季节的交替、地域的跨越、动物个体或群体的差异，这些不同均会造成血清的批次间差异。另外，血清的组成存在可变性和不一致性，这也会导致培养基对细胞具有不一致的促生长能力。此外，每批培养基的质量会随着供体奶牛的饮食和身体状况的变化而变化。这种变化也会导致培养基的促生长特性发生显著差异，最终导致细胞培养过程的生长能力和速度的巨大差别。

1.4 成分问题

动物血清成分复杂，其包含有促进细胞生长的重要营养物质和活性成分。还含有少量的细胞毒性物质和抑制成分，这些成分会影响细胞的生长与表达。此外，在生物反应器中生长的细胞通常是将目标产物（一般是蛋白质）分泌到培养基质中。如果培养基所用的是10%的血清，血清中的蛋白质浓度通常很高，接近10 g/L。 相比之下，由细胞分泌的靶向蛋白质的浓度大多数情况下仅仅有0.1～1g/L，在这种情况下，想要将细胞的目标产物和血清中的蛋白分离将会面临很大的挑战。更甚，如果我们的细胞目标产物是单克隆抗体，则其会与血清中存在的其他抗体混合，这将导致两者的分离工作更加困难。

1.5 高污染风险问题

污染通常来自存在于动物血清中的病毒和支原体以及与牛海绵状脑病相关的朊病毒。有研究表明35%～50%的商业含血清培养基是病毒阳性［2］。另有研究表明，来源于肉制品的新型Creutzfeldt-Jakob病（人类版本的牛海绵状脑病）的发生很大原因要归咎于培养基中添加了牛血清。虽然被污染的生物制剂可能不会最终走向市场，但也没有人想要在制造的生物制药中冒这种污染的风险去生产。

2 无血清培养基的发现

20世纪50年代，Eagle等科学家通过采用科学的研究手段确定了哺乳动物细胞生长所需的营养物质组成成分，并通过试验确定了可以促进细胞生长时这些营养物质在培养基中的最低成分，Eagle等的这些发现丰富了人们对无血清培养基的认识，当时普遍得出结论认为最小必需培养基至少得包括13种氨基酸、8种维生素和6种离子物质及其它微量组分［3］。向培养基中添加动物来源的血清可以为动物细胞提供细胞生长的营养需求，但实验证明向培养物中增加Eagle最小必需培养基的组分浓度可获得同样的细胞密度。向基础配方 （如Dulbecco's Egles培养基（DMEM））中调整营养成分的添加量可以选择出细胞系的克隆细胞。Ham早期研究生产出众所周知的Ham's F-12培养基，随后，佐藤巧妙将Dulbecco's Egles培养基和Ham's F-12培养基混合得到混合基础培养基制剂DMEM/F-12，这种混合的基础培养基制剂一段时间被广泛用于多种细胞系生长至高密度［4］。这些明确成分的基础培养基制剂中含有多达70种补充组分，但它们中的每种成分对于提供大多数细胞系的持续生长都是必要的。目前，已有大量试验数据证实无血清培养基不但可以避免或改善由含血清培养基所带来的各种缺陷，而且在能得到优良的培养效果的同时还可以维持细胞原有生物学功能［5］。

使用动物血清作为培养细胞重要营养物质的来源存在诸多问题，这些使得科学家们对无血清培养基的开发产生了越来越强烈的欲望。在科学研究领域，无血清培养基对于保证培养基一致性以及降低血清批次间差异性具有重要的作用。在工业生产领域中，对细胞大规模培养工艺也会产生很大影响。使用无血清培养基能很大程度地降低朊病毒对细胞污染的风险，在主流欧美发达国家，各个国家监管当局已经要求尽可能使用无血清培养基生产生物制品。欧洲替代方法研究中心科学咨询委员会和欧洲体外毒理学会等多个机构组织均发表声明，强烈建议减少或终止细胞体外培养过程中血清等动物源性物质的添加，尽可能在现有细胞培养领域使用无血清培养基［6］。由此可见，无血清细胞培养技术的研究日益受到人们的重视，并开始逐渐成为当今动物细胞体外培养领域研究的重点与趋向。

3 无血清培养基的发展历程

无血清培养基是从合成培养基的发展基础上逐步发展起来的，无血清培养基与传统的含血清培养基进行对比，不但可以满足细胞在培养瓶内长时间培养的要求，而且可以避免使用动物血清所带来的不利影响。无血清培养基发展至今，大致经过了以下三个阶段，第四代培养基的研制开发并投入市场将成为当今的发展趋势［7］。

3.1 无血清培养基(Serum-Free Medium，SFM)

无血清培养基，顾名思义，为不添加动物来源血清的培养基。可是为了满足细胞的生长要求，常会向培养基中添加替代血清生物功能的原料，如一些动植物的提取物、转铁蛋白、胰岛素等。这些添加物使得此类培养基中含大量动植物来源蛋白，添加动植物的提取物使得培养基化学成分也变得不够明确。因此，会对后续处理应用造成不利影响（如目标蛋白的分离纯化），同时也会增加成本。在具体的实验过程中，由于人们可以就实际需求对培养基进行相对简单的成分改进，使得此类培养基的应用至今仍较为广泛。不含血清，但含有大量的动物或植物来源蛋白，蛋白含量偏高(低于有血清培养基)，不利于目标蛋白如BSA和动物激素等蛋白的分离纯化，降低了回收率，增加了成本，这些均是此类培养基目前存在的缺点。

3.2 无动物源培养基（Animal Component Free Medium，ACFM）

无动物源培养基是利用化学重组蛋白、有机化学物质、其他水解物来取代动物源蛋白。此类培养基完全不用动物来源蛋白 (也无动物衍生蛋白），其大大降低了生产成本，加快了报批的速度，其具有诸多优点，是目前生物市场上销售的主要无血清培养基产品。

3.3 无蛋白培养基(Protein-Free Medium，PFM)

无蛋白培养基完全不含有血清蛋白和动物来源蛋白，但其中仍会添加来源于植物的蛋白水解物或合成的多肽片段以及其他衍生物。但此类培养基蛋白质添加量极低，并且蛋白质成分特别明确。这些均有利于细胞蛋白质产品的下游生产、分离和纯化，总体成本也会大幅下降［8-9］。但此类培养基同样具有缺点，其通用性较差，需要针对目标细胞株进行特异性的优化［10］。

3.4 化学成分限定培养基(Chemically Defined Medium，CDM)

化学成分限定培养基特点是完全无血清、无蛋白、成分完全明确，可以保证培养基批次间的一致性和无差异性。除此之外，化学成分限定培养基适合多种不同细胞生长而且可以对其进行高温消毒。第四代培养基的研究和使用将成为发展重点和趋势。

4 无血清培养基的组成及其主要添加因子

无血清培养基由基础培养和合适比例的激素、生长因子、贴壁因子和结合蛋白等添加因子而组成。

4.1 基础培养基

基础培养基通常是将葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素等按一定比例组合而成的合成培养基，基础培养基对于维持组织或细胞生长代谢必不可少。其成分是完全已知的，因此在对不同的细胞株进行培养时可以对基础培养基的某些组分添加量进行相应的调整，从而更好的符合细胞株的营养要求并提高目的蛋白的表达产量。

4.2 主要添加因子

截止目前，人们已经发现多数生物材料因子单独添加或一起使用可替代血清在细胞培养中的功效。很多研究表明，不同来源的细胞其营养需求有差别［11］。即使同一个细胞系中为不同种细胞设计的培养基其补加成分也不尽相同，但对于大多数细胞系(株)而言，主要添加因子有以下几种。

4.2.1激素和生长因子。多半细胞在使用无血清培养时需要加入某些激素，比如胰高血糖素、生长激素和胰岛素等。其中，胰岛素是最为重要的一类激素。大多数细胞系都需要加入胰岛素，胰岛素是一种常见的多肽，其可以和细胞膜上的胰岛素受体结合形成复合体，其可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸三者的合成，起到抑制细胞凋亡的作用，是比较重要的细胞存活因子。除了胰岛素外，很多哺乳动物细胞还需要一定量的其它多种激素。比如像多肽类激素中的甲状腺素、胰高血糖素甲状生长激素等，甾体类激素中的雌二醇、氢化可的松和孕酮等。不同细胞株对激素的种类和数量要求有所不同，常用的激素和溶度见表1。

表1 常用的激素和溶度

生长因子，其是维持细胞体外生长增殖、分裂分化所必需的生物补充因子。按其化学性质进行分类，可将其分为多肽类生长因子和甾类生长因子。无血清培养基中添加的生长因子通常是多肽类生长因子。较常用的有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和神经生长因子。有研究证明表皮生长因子的添加量要依据各种细胞的生长特性的不同而做出改变，但其通常添加的溶度范围一般在1～100ng·mL-1之间；神经生长因子的添加量较表皮生长因子较低，添加溶度一般控制在1～10ng·mL-1之间；成纤维素细胞生长因子的添加溶度一般控制在1～100μg·mL-1之间。

4.2.2结合蛋白。在无血清培养基中，添加结合蛋白是非常有必要的。通常添加的结合蛋白包括两种蛋白质，一种是转铁蛋白，另外一种是白蛋白。

转铁蛋白是细胞无血清培养中最重要的补充因子之一，它可以促进细胞的生长，同时它也是一些有害微量元素的螯合剂［12］。

白蛋白可以作为微量营养素的载体，其可保护细胞免受不利pH波动和剪切力对细胞造成的影响。同时，白蛋白也是无血清培养基中最重要的添加因子之一。其通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合，起到稳定和调节上述物质在无血清培养中的活性作用。除此之外，其还具有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用［13］。

4.2.3贴壁因子。绝大多数的真核细胞在体外生长时是需要固着在适宜的基底上。细胞固着是一个比较复杂的过程，包括贴壁因子吸附于器皿或载体的表面、细胞与贴壁因子的结合等。无血清培养中常用的贴壁因子有细胞间质成分和血清中的成分，如纤粘连蛋白、胶原、昆布氨酸和多聚赖氨酸。

4.2.4微量元素。微量元素是细胞体外培养的一类重要添加因子，而硒是其中最常见的微量元素，有研究表明，硒在任何一种细胞尤其是在人体细胞的生长过程中起到特别重要的作用。在生物代谢方面，微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，可以消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害。亚硒酸钠的最适添加浓度是30～60nmol·L-1［14］。

5 发展无血清培养基遇到的问题及其开发设计

5.1 遇到的问题

发展无血清培养基要克服的主要困难是不能找到等同作用的生长促进因子。生长促进因子的添加在不同的细胞系中存在很大差异，包括培养基中生长促进因子的添加种类差异和生长促进因子的添加量差异。培养细胞需要广泛的生物活性成分，设计出一种普遍适用的无血清制剂作为适合所有细胞系的血清替代物目前还面临诸多困境。有研究表明，很多细胞系的不同克隆株对无血清制剂的要求甚至也不一样。

发展无血清培养基制剂的目的是替代培养基中血清的功效，无血清培养基制剂需要补充生长因子、维生素、微量元素、激素和基础培养基未提供的其他微量营养素等必需组分。科学家早期开发无血清培养基制剂时将动物来源的成分归纳为胰岛素、转铁蛋白、白蛋白和胆固醇替代物。然而，这种培养基制剂仍然具有含有相对高的蛋白质含量和源自动物来源的成分的缺点。没有典型无血清培养基的特点：无蛋白质成分（PF）和动物衍生成分（ADCF）的两个重要标准。

在食品工业中广泛使用的植物和微生物来源肽水解产物，目前已经成为促进哺乳动物细胞生长的非动物成分的主要来源。科学家们通常通过统计学实验方案的设计，将各种来源如大豆、小麦面筋和酵母的最佳混合物补充到培养基中。通过这些水解物和混合物中的营养成分和生长因子的组合优化以促进细胞生长［15］。有研究表明这些生物活性成分具有明显的优点，当然也存在一些问题，比如尽管可以改进处理方法使水解产物的批次间变化最小化［16］，但对于这些水解产物含量的批次间变化还是有差异。

5.2 开发设计

据报道，有超过450种不同的无血清制剂可用于各种细胞系的培养［17］。 但不足的是，这些培养基是专有的，只能用于培养单一种细胞。

目前，可以使用多种策略设计无血清制剂。使用标准基础培养基进行不同组合，并将血清降低至细胞生长的最低水平。在培养过程中对特定营养的摄取率和消耗量进行测定，进行代谢分析识别补充关键组分的要求。用Plackett-Burman矩阵实验统计设计可以确定生长时最大生产力关键组分的最佳混合物溶度［18］。其是通过利用cDNA微阵列分析提取的RNA，对细胞生长期间表达的特异性受体的微阵列分析鉴定，然后用相应的配体补充培养基以刺激相关的信号通路［19］。使用这些技术，可以设计出所需标准的无血清培养基，可以满足细胞高生长速率、高细胞产量、高生产力的要求。

6 展望

无血清培养基经过几十年的发展，已经经历了三次大变革。虽然尚存在着诸多不足，如只能用于一种或少数几种细胞高密度生长或高水平表达目的产物，缺少通用性；培养基相对较难保存；无血清培养基制剂的使用成本还是比较昂贵。但伴随着人们对细胞代谢和外源蛋白表达机制以及细胞凋亡的机制的认识的愈加深入、细胞培养基的不断优化、实验过程中更加科学便捷的方法的采用。无血清培养基的发展将会越来越好。针对无血清培养基通用性的问题，有待于研究具有广泛适应性的培养基。另外，无血清培养基目前还存在成本较高的问题，因此，降低无血清培养基成本的方法值得探索。培养基的保存方法问题也急需科学家们去解决。其次，将无血清培养基与反应器大规模培养技术相结合将会成为新的研究热点，如何将无血清培养基和反应器大规模培养技术生产目的产物将有待于我们的持续研究和探索。

［1］ van der ValkJ，Mellor D，Brands R，et al.The humane collection of fe-tal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture ［J］ Toxicology in Vitro，2004，18(1)∶1～12．

［2］ WessmanSJ，LevingsRL.Benefits and risks due to animal serum used in cell culture production Dev.Biol.Stand.1999（99），3～8.

［3］ Eagle H.Amino acid metabolism in mammalian cell cultures.Science，1959，130(3373)，432～437.

［4］ Jayme D，WatanabeT，ShimadaT.Basal medi um development for serum-free culture∶a historical perspective.Cytotech-nology，2007，23(1～3)，95～101.

［5］ SwamynathanP，VenugopalP，KannanS，etal.Are serum-free and xeno-free culture conditions ideal for large scale clinical grade expansion of Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells.A comparative study ［J］.Stem Cell Research&Therapy，2014，5(4)8∶8.

［6］郭纪元.CHO DG44稳定细胞株无血清培养基的研发与优化［D］.厦门∶厦门大学生命科学学院，2014．

［7］ NienkeVriexen，BastiaanRomein et al.Bioteehnology and Bioengieering，2007，54∶273～286.

［8］ Cardoso T C，Teixeira M C，Fachin N， et al.Evaluation of serum and animal protein-free media for the production of infections bronchitis virus(M41)Strain in a continuous cell line［J］.Altex，2009，22(3)∶152～156.

［9］ SpensE.Haggstrom L∶Defined protein-free NS0 myeloma cell cultures stimulation of proliferation by conditioned medium factors ［J］.Biotechnology Progress，2014，21(1)∶87～95.

［10］ Schroder M，MatischakK，FriedlP.Serum-and protein-free media fomulation for the Chinese hamster ovary cell line DUKXB11［J］.Journal of Biotechnology，2004，108(3)∶279～292.

［11］ BurteauCC，VerhoeyeFR， MolsJF， BallezJS， AgathosSN，Schneider YJ.Fortification of a protein-free cell culture medium with plant peptones improves cultivation and productivity of an interferon-gamma CHO cell line.In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim，2009，39(7)，291～296.

［12］ RourouS，van der Ark A，van der VeldenT，etal.Development of anAnnimal-component free medium for vero cells culture［J］.Biotechnology Progress，2009，25(6)∶1752～1761.

［13］ Glassy MC，TharakanJP，ChauPC.Serum-free media in hybrido-ma culture and monoclonal antibody production ［J］.Biotech&Bio-eng 1998（32）∶1015～ 1028.

［14］薛庆善编，体外培养的原理与技术［M］.北京科学技术出版社，2001，162～164.

［15］ BurteauCC，VerhoeyeFR，MolsJF，BallezJS，AgathosSN，SchneiderYJ.Fortification of a protein-free cell culture medium with plant peptones improves cultivation and productivity of an interferon gamma producing CHO cell line.In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim，2003，39(7)， 291～296.

［16］ SiemensmaA，BabcockJ，WilcoxC，HuntingaH.Towards an understangding of how protein hydrolysates stimulate more efficient biosynthesis in cultured cells.In∶Protein Hydrolysates in Biotechnology.Pasupuleti VK， Demain AL(Eds).Springer，Dordrecht，Germany，2010，33～54.

［17］ Van Der ValkJ.BrunnerD，DeSmet K et al.Optimization of chemically defined cell culture media–replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods.Toxicol.In Vitro 2010，24(4)，1053～1063.

［18］ Gonzalez-Leal IJ，Carrillo-CocomLM，Ramirez-Medrano A et al.Use of a Plackett–Burman statistical design to determine the effect of selected amino acids on monoclonal antibody production in CHO cells.Biotechnol.Prog，2011，27(6)，1709～1717.

［19］ Allison DW，AboytesKA，Fong DK et al.Development and optimization of cell culture media genomic and proteomic approaches.BioProcessInt，2005，3(1).