透骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠关节软骨Gαs、Gα（i）、Gα（pan）的影响

黄艳峰+李丹帆+陈俊+林秋英+叶锦霞+吴广文

【摘 要】目的：探讨透骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠关节软骨G蛋白偶联信号传导系统的影响。方法：2月龄清洁级雄性SD大鼠36只，喂养1周后，随机分为空白组12只和造模组24只。造模组在第1，4，7天双膝关节腔注射0.2 mL质量分数为4%的木瓜蛋白酶。造模成功后，抽签法随机分为模型组和透骨消痛胶囊组，每组12只。透骨消痛胶囊组按照3.6 g·kg-1·d-1的剂量灌服透骨消痛胶囊，空白组、模型组给予等量生理盐水。12周后取关节软骨，采用Western blot技术检测关节软骨中Gαs、Gα（i）、Gα（pan）蛋白表达。结果：与空白組比较，模型组Gαs、Gα（pan）表达量下降，Gα（i）表达量上升，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，透骨消痛胶囊组Gαs、Gα（pan）表达量上升，Gα（i）表达量下降，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。结论：透骨消痛胶囊可能通过激活G蛋白偶联信号传导系统，延缓关节软骨的退变。

【关键词】 骨关节炎，膝；透骨消痛胶囊；G蛋白偶联信号传导系统；软骨退变

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛胶囊）on G protein coupled signal transduction system of articular cartilage in rats with knee osteoarthritis.Methods：Thirty-six two-month male SD rats fed for a week were randomly divided into a blank group（12 rats）and a model group（24 rats）.The model group was injected with 0.2 mL of papain（with mass fraction of 4%）into articular cavities of both knees at the first，fourth，and seventh days.After the the models were established，they were randomly divided into a model group and a Tougu Xiaotong Jiaonang group，twelve rats in each group.The Tougu Xiaotong Jiaonang group was drenched with Tougu Xiaotong Jiaonang（3.6 g·kg-1·d-1），while the control group and the model group were given normal saline.After twelve weeks，the articular cartilage was taken and the expressions of protein Gαs，Gα（i）and Gα（pan）in articular cartilage were detected by Western blot technique.Results：Compared with the control group，the expression of Gαs and Gα（pan）in the model group decreased，while the expression of Gα（i）increased，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.Compared with the model group，the expressions of Gαs and Gα（pan）in the Tougu Xiaotong Jiaonang group increased and the expression of Gα（i）decreased，and the difference wasstatistically significant（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：Tougu Xiaotong Jiaonang may delay the degeneration of articular cartilage by activating G protein coupled signal transduction system.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛胶囊）；G protein coupled signal transduction system；cartilage degeneration

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是关节软骨退行性改变继发引起的一种慢性关节疾病[1]。软骨退变是骨关节炎（osteoarthritis，OA）的主要病理改变，而软骨细胞凋亡在软骨退变过程中发挥重要作用[2]，目前尚无特效药及方法阻止疾病的进展。透骨消痛胶囊是福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂，能有效改善KOA患者临床症状[3]，保护关节软骨[4-9]，但其作用机制不明。G蛋白偶联信号传导系统是一类重要的细胞跨膜信号传导途径之一，在软骨细胞凋亡中起重要的调控作用，参与软骨退变[10-11]。因此，本研究从G蛋白偶联信号传导系统探讨透骨消痛胶囊延缓KOA软骨退变的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 36只清洁级2月龄雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002。实验动物处理方法参照《关于善待实验动物的指导性意见》执行。endprint

1.2 实验药物 透骨消痛胶囊（闽制字Z20100006）由福建中医药大学附属第二人民医院提供。

1.3 主要试剂 Gαs（K-20）抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；Gα（i）、Gα（pan）、β-actin和羊抗兔二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）。

1.4 主要仪器 LX-800酶标仪（美国BioTek公司）；化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）；低温高速离心机（德国eppendorf公司）。

2 方 法

2.1 分组与模型制备 36只雄性SD大鼠，喂养1周后，随机分为空白组12只和造模组24只。空白组不做任何处理。造模组在第1，4，7天双膝关节腔注射0.2 mL质量分数为4%的木瓜蛋白酶[4]。

术后2周拍摄膝关节DR片进行模型鉴定。鉴定成功后，按随机数字表法将造模组24只随机分为模型组和透骨消痛胶囊组（TGXTC组），每组12只。

根据人和动物药物临床等效剂量换算[12]，TGXTC组按3.6 g·kg-1·d-1的剂量灌胃透骨消痛胶囊，空白组、模型组给予等量生理盐水灌胃。造模组和TGXTC组实验过程中各脱落1只。

2.2 取材与处理 连续灌胃12周后，取双膝关节软骨，迅速放入液氮中保存，用于后期相关指标检测。

2.3 Western blot检测G蛋白偶联信号传导系统Gαs、Gα（i）、Gα（pan）蛋白表达 将膝关节软骨置于高温消毒后的研钵中，加入液氮迅速研磨，之后按1 g∶3 mL比例加入蛋白裂解液，提取蛋白。之后按照4∶1比例加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃变性10 min，保存蛋白。根据BCA蛋白定量结果，每孔按40 μg蛋白进行上样，经质量分数为12%的SDS-PAGE凝膠电泳分离，采用半干转的方法将蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，PVDF膜上加入体积分数为5%的脱脂奶粉，室温封闭2 h，4 ℃分别加抗体Gαs（1∶500）、Gα（i）（1∶1000）、Gα（pan）（1∶1000）、β-actin（1∶1000）过夜，次日室温下二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，滴加200 μL ECL化学发光剂，曝光显影。Bio-Rad Image Lab图像处理软件，分析目的蛋白和内参β-actin条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

2.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以表示，2组间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）；不符合正态分布的计量资料采用秩和检验。所有检验均采用双侧检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 KOA模型鉴定结果 空白组关节间隙正常、关节面平整、关节边缘可见光滑锐利的线样致密影，软骨下骨密度均匀。模型组关节间隙明显变窄、关节面不平整，软骨破坏区边缘骨质增生、硬化，关节边缘骨赘形成。见图1。

3.2 透骨消痛胶囊对Gαs、Gα（i）、Gα（pan）蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组Gαs、Gα（pan）的表达量下降，Gα（i）的表达量上升，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，TGXTC组治疗12周后，Gαs、Gα（pan）的表达量上升，Gα（i）的表达量下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图2。

4 讨 论

KOA属中医学“痹证”范畴。其病理特点为“本虚标实，本痿标痹”，主要病因病机为肝肾亏虚，气血不足，寒瘀阻滞[13]。肝肾亏虚是OA病变的根本，与神经-内分泌-免疫网络功能紊乱密切相关[14]。中医肝肾功能集中反映下丘脑-垂体-靶腺轴的功能，反映这几个轴功能下降的指标是肝肾亏虚较为特异的指标，而G蛋白偶联信号传导系统是下丘脑-垂体-靶腺轴的重要执行者[15]。

G蛋白偶联信号传导系统主要由激动型G蛋白（Gs）、抑制型G蛋白（Gi）和磷脂酶C型G蛋白（Gp）组成，不同的G蛋白能特异地将受体和与之相应的效应酶偶联，活化相应酶和离子通道，产生重要的第二信使，从而介导软骨细胞线粒体凋亡信号转导通路，参与软骨退变[10-11]。此外，线粒体是真核细胞内重要的细胞器，在生理情况下，为细胞提供能量；在病理情况下，线粒体结构功能的改变在细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用，通过Bcl-2家族蛋白中促凋亡与抗凋亡蛋白之间的相互作用控制线粒体外膜通透性，在细胞内外众多凋亡刺激因素下，促使多种促细胞凋亡因子从线粒体内外膜间隙释放到胞质，激活Caspase-9；Caspase-9再激活Caspase-3，从而启动细胞的凋亡程序[16-17]。而软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，软骨细胞的增殖、分化、凋亡在OA的病理进程中发挥重要作用。因此，有效调控G蛋白偶联信号传导系统，抑制软骨细胞凋亡，可能是防治OA的一个有效途径。

透骨消痛胶囊由巴戟天、白芍、肿节风、川芎组成。方中巴戟天温阳补肾为君药，白芍养血柔肝为臣药，川芎活血行血、肿节风祛风除湿为佐使药，共奏补肾柔肝、活血祛风之功。正是以中医“肾主骨”“肝主筋”理论为指导，针对KOA病机组方。前期研究发现，该方可多层面、多途径、多靶点治疗KOA，通过调控信号传导通路，调节机体的免疫应答以及细胞的增殖、分化及凋亡[18]。

KOA动物模型是研究OA发病机制的重要手段。前期研究发现，关节内注射质量分数为4%的木瓜蛋白酶可成功复制KOA动物模型[19-22]。本研究中，造模组大鼠在第1，4，7天双膝关节腔注射0.2 mL质量分数为4%的木瓜蛋白酶，2周后，拍摄膝关节DR片，结果发现，空白组关节间隙正常，关节面平整，软骨下骨密度均匀。而造模组则呈现关节间隙明显变窄，关节面不平整，关节边缘骨赘形成等KOA病理学改变，进一步证实注射质量分数为4%的木瓜蛋白酶复制KOA模型的可行性，也为后期的研究奠定基础。另外，本次研究发现，透骨消痛胶囊可以升高Gαs、Gα（pan）蛋白的表达水平，降低Gα（i）蛋白的表达水平，提示透骨消痛胶囊可能通过激活G蛋白偶联信号传导通路，抑制细胞凋亡，最终延缓KOA软骨退变。但是，由于引起KOA的因素较多，且透骨消痛胶囊组分多且复杂，详细作用机制有待后期进一步深入研究。endprint

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收稿日期：2017-09-20；修回日期：2017-10-27endprint