纳米氧化铟改性的碳纳米管吸附剂的制备及其在食品防腐剂检测中的应用

黄玮

摘 要 建立了以氧化铟（In2O3）纳米粒子改性的多壁碳纳米管 （In2O3MWCNTs） 为固相萃取吸附剂，与高效液相色谱联用，同时检测红酒及果汁中3种防腐剂（苯甲酸、山梨酸和尼泊金甲酯）的研究方法。本研究利用In2O3纳米粒子较大的比表面积及所含丰富的基团，以及碳纳米管良好的热稳定性和化学稳定性，制备了In2O3MWCNTs吸附剂。分别采用透射电镜、热重分析及傅立叶变换红外光谱对吸附剂进行表征，通过正交实验得到最优萃取条件为： 吸附剂用量0.15 g、样品体积5.0 mL、洗脱液为ACNH2O （60∶40，0.1%甲酸，V/V）、洗脱液体积0.6 mL、样品pH=4.0。在最佳萃取条件下，3种防腐剂的方法检出限为0.004～0.012 μg/mL，定量限为0.012～0.038 μg/mL，样品加标回收率为70.2%～109.4%。本方法快速、灵敏，能够满足食品样品中防腐剂含量的检测要求。

关键词 氧化铟纳米粒子； 多壁碳纳米管； 吸附剂； 食品防腐剂

1 引 言

苯甲酸、山梨酸和尼泊金甲酯是较为常用的防腐剂，可防止食品变质发酸、延长保质期。但过量服用苯甲酸或其钠盐，会导致神经系统损伤等危害[1]。山梨酸及其钾盐虽然被认为是高效、低毒的食品添加剂，能参与人类正常代谢，但过多地摄入可导致人体酸中毒、抽搐[2]。尼泊金酯作为一种中性的食品防腐剂，效果明显优于山梨酸和苯甲酸，并且用量少、毒性低，一直被认为是高效、低毒和安全的防腐剂，但新的研究表明，尼泊金酯类物质具有弱雌激素作用和抗甲状腺效应[3]。由于防腐剂本身具有一定的毒性，对食品中防腐剂的定量分析具有非常重要的应用价值。

固相萃取 （SPE） 的操作简单、快速，能提高分析结果的重现性，近年被广泛应用于临床医学、药品分析、环境分析、食品安全、生命科学等众多领域[4～7]，SPE技术因其具有特殊的优势在食品分析领域也占有重要地位[8，9]。影响SPE效率的关键是吸附材料的选择。作为一种新型吸附材料，碳纳米管具有热稳定性和化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大的优点[9，10]，其中，多壁碳纳米管 （MWCNTs）[10～12]通常存在较多的结晶碳杂质和严重的缠绕团聚现象，影响碳纳米管的应用，必须对其进行改性和纯化。基于纳米材料的高比表面积、强的表面吸附能力及良好的机械稳定性，很多研究者利用纳米材料对MWCNTs进行改性，经过改性的MWCNTs能有效地分离富集小分子化合物[13，14]。In2O3纳米粒子是一种新型功能材料，具有立方铁锰矿结构[15]，由于其优异的电学和光学特性，In2O3纳米粒子在太阳能电池、固态气体传感器和光电薄膜材料等方面得到了广泛应用[16～18]。In2O3由于较大的比表面积和表面丰富的羟基，在吸附分析分离方面具有极大应用潜力[16]。

本研究利用In2O3具有较大的比表面积，其表面所含的丰富的基团，以及MWCNTs微孔结构丰富和性质稳定等特点，制备了In2O3修饰的MWCNTs，将其作为分离富集介质，采用SPE和HPLC联用，建立了快速、灵敏分析红酒和果汁中3种防腐剂含量的方法。采用正交设计法对影响萃取效果的重要因素进行了优化，考察了吸附剂的重现性和稳定性。实验结果表明，In2O3MWCNTs吸附剂对3种目标化合物具有较好的选择性，回收率令人满意。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Shimadzu LC20A高效液相色谱仪，配有LC20AT 二元泵、SIL20A自动进样器、CTO20A柱温箱、SPD20A UVVis检测器和Labsolutions工作软件（岛津公司）。色谱柱为反向Diamonsil C18液相色谱柱 （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）。流动相A为0.02 mol/L醋酸铵溶液 （pH = 6.8），流动相B为甲醇； 梯度洗脱： 0～9 min， 20% A； 9～10 min， 20%～95% A； 10～17 min， 95% A； 17～18 min， 95%～20% A； 18～25 min， 20% A，直到分析結束。紫外检测波长为234 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30℃，进样体积为10 μL。

ASE24固相萃取仪（天津奥特赛恩斯仪器公司）； UFSCX固相萃取小柱（大连中谱科技有限公司）； pH10型酸度计（北京赛多利斯科学仪器公司）； MilliQ SP型纯水系统（美国Millipore公司）； ZK82BB真空干燥箱（上海实验仪器有限公司）； LD52A离心机（北京京立仪器公司）； JSM 2000F透射电子显微镜（日本JEOL公司）； TENSORⅡ红外光谱仪（德国Bruker仪器公司）； Q500热重分析仪（美国TA公司）。

苯甲酸、山梨酸、尼泊金甲酯标准品、In2（SO4）3（上海阿拉丁化学试剂有限公司）； 1000 μg/mL的3种防腐剂标准品的储备液由去离子水进行稀释，标准溶液于4℃密封保存，即用即配。0.02 mol/L的磷酸盐缓冲溶液由NaH2PO4配制。乙醇、NaH2PO4、H3PO4和NaOH（分析纯，北京化工厂）； H2SO4、HNO3、NH3·H2O、石英砂、甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）； 甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）。多壁碳纳米管 （MWCNTs，管径30～50 nm，深圳Nanoport有限公司）。

2.2 In2O3MWCNTs吸附剂的制备

称取1 g MWCNTs加入100 mL 2 mol/L NaOH溶液中，超声振荡30 min，然后加热到120℃回流2 h，冷却后过滤，并用超纯水冲洗直至滤液pH=7.0，烘干后研磨； 将其加入到H2SO4HNO3（3∶1，V/V）混合酸溶液中，120℃下加热回流1 h，用超纯水冲洗至滤液呈中性，在真空烘箱中烘干后即得到羧基功能化的多壁碳纳米管（MWCNTsCOOH）。endprint

取1 g In2（SO4）3溶于100 mL 超纯水中，加入0.1 g MWCNTsCOOH，超声30 min，使碳纳米管分散均匀，并在超声作用下将20 mL 1 mol/L NH3·H2O缓慢滴入碳纳米管分散溶液中，静置24 h后过滤，并在60℃下烘干，研磨后获得MWCNTs/In（OH）3前驱体。 在氮气保护下将MWCNTs/In（OH）3前驱体在马弗炉中煅烧2 h，煅烧温度分别为450、600和750℃，得到氧化铟/碳纳米管复合粉体 （In2O3MWCNTs），制备过程如图1所示。可以分为4个步骤： （1） MWCNTs经过混合酸处理后，表面上形成OH，COOH， CO等负电基团； （2） 在共沉淀过程中In3+通过阴阳离子静电吸引力的相互作用吸附在MWCNTs周围； （3） 加入NH3·H2O后，大量In（OH）3前驱体包覆在MWCNTs周围，形成In（OH）3前驱体包覆的MWCNTs纳米复合材料； （4） 经过锻烧后，形成了In2O3MWCNTs纳米复合材料。

2.3 In2O3MWCNTs固相萃取小柱的制备

将商品化固相萃取小柱空管和聚乙烯柱筛板用超纯水和乙醇清洗、干燥，用筛板封住SPE柱底部，称取0.15 g In2O3MWCNTs和0.05 g石英砂，加入固相萃取小柱中，垫上柱筛板，压实，通过调节上筛板将In2O3MWCNTs填料厚度控制在0.6 cm，即制得In2O3MWCNTs固相萃取小柱。

2.4 固相萃取步骤

依次用2 mL 超纯水、2 mL 甲醇和2 mL磷酸盐缓冲溶液活化固相萃取小柱，再将一定浓度的样品溶液引入小柱，使其流经装有In2O3MWCNTs的固相萃取柱进行样品预富集，用2 mL磷酸盐缓冲溶液冲洗小柱，最后用合适的洗脱液洗脱目标物，洗脱液经0.45 μm滤膜过滤后，利用HPLC检测。

3 结果与讨论

3.1 In2O3MWCNTs吸附剂的表征

3.1.1 透射电镜表征 图2为纳米In2O3和In2O3MWCNTs的TEM图。从图2A可见，制备的In2O3呈圆球状，平均尺寸为50～60 nm。由In2O3MWCNTs复合材料的TEM图（图2B） 可见，基体In2O3的形貌基本没有变化，附着在MWCNTs外表面上的In2O3纳米颗粒是由多个In2O3纳米晶粒定向聚合而成，这种复合结构非常利于有机物的吸附。

3.1.3 热重分析 为了考察In2O3MWCNTs吸附剂的热稳定性，对该材料进行热重分析（图4），在N2氛围下以10℃/min的升溢速率测定在100～800℃温度范围内的In2O3MWCNTs吸附剂的热分解行为。100～300℃的失重主要是由于吸附剂表面的水分子或有机小分子化合物的挥发[21]。400℃～600℃吸附剂材料发生明显的重量损失； 当温度高于600℃时，热重曲线趋于平衡。说明合成的吸附剂材料热稳定性良好。

3.2 实验参数的优化

3.2.1 SPE条件的优化 为了能使In2O3MWCNTs吸附剂达到最佳的萃取效率，我们首先选择了洗脱液的种类、吸附剂用量、样品体积、样品pH值、洗脱液体积5个萃取条件进行了单因素优化实验，使用的3种防腐剂标准溶液的浓度均为1.0 μg/mL。

分别选择MeOH、MeOHH2O（0.1%甲酸）、ACN、ACNH2O（0.1%甲酸）为洗脱液，考察洗脱液组成对3种防腐剂的洗脱效果。结果表明，ACNH2O（0.1%甲酸）洗脱效果较好。考察了ACNH2O的比例分别为10∶90、20∶80、40∶60、50∶50、60∶40、80∶20、90∶10为洗脱液的洗脱效果，ACNH2O（60∶40，0.1%甲酸，V/V）的洗脱效果明显好于其它溶液，因此，本实验选择ACNH2O（60∶40，0.1%甲酸，V/V）作为洗脱液。

通过单因素优化实验，选取了样品体积（2.0～5.0 mL）、样品pH值（2.0～5.0）、洗脫液体积（0.5～1.0 mL）、吸附剂用量（0.05～0.15 g）通过L16 （44）（4因素4水平）正交实验进行进一步优化，每组实验以3种防腐剂的峰面积总和为响应指标。

通过16组数据正交实验分析最终确定出最佳的吸附条件，每组数据重复两次。各因素不同水平估算边际均值如图5。样品体积对目标物质的吸附效率随着体积的增大而显著增加，表明In2O3MWCNTs吸附剂对目标物有优异的负载能力。当pH为4.0时，吸附剂对3种防腐剂的吸附效率达到最高，这可能与目标防腐剂和吸附材料之间存在的静电作用和氢键作用有关。因此，最终选择pH 4.0为最佳样品pH。随着洗脱液体积的增大，吸附效率呈现先增大后减小的趋势。过少的洗脱液不能保证样品溶液中目标物的完全洗脱，过多的洗脱液会导致低的灵敏度和较长的操作时间，并且洗脱液过多，也会造成样品被稀释，降低吸附效率。吸附剂对3种防腐剂的吸附随着In2O3MWCNTs用量的增加而增大，吸附剂用量过小，柱容量低，分析物不能被充分吸附； 用量过大，既增加了填料对分析物的吸附作用，导致难以被洗脱下来，也会引起过柱时操作阻力明显增大而增加耗时。最终得到最优条件为样品体积5.0 mL、样品pH值4.0、洗脱液体积0.6 mL、吸附剂用量0.15 g。

3.3 方法评价

3.3.1 方法评价 在上述优化的实验条件下，采用In2O3MWCNTs固相萃取柱对3种防腐剂进行萃取、洗脱和检测，对于0.010～10 μg/mL的苯甲酸以及0.050～10 μg/mL的山梨酸和尼泊金甲酯， 3种防腐剂都具有较好的线性关系，相关系数 （R2） 均大于0.9901。检出限 （LOD，S/N=3） 和定量限 （LOQ， S/N=10）分别在0.004～0.012 μg/mL和0.012～0.038 μg/mL范围内。方法的日内（n=3）和日间 （n=3，连续3 d） 精密度分别为0.2%～1.5%和1.1%～3.6%，结果如表1所示。endprint

3.3.2 方法对比 在最佳实验条件下，将混合酸处理的MWCNTs和In2O3MWCNTs吸附剂对3种防腐剂萃取的分析结果与未进行萃取直接HPLC分析的结果进行对比 （图6）。结果表明，混合酸处理的MWCNTs对3种防腐剂有一定的富集能力，而经In2O3MWCNTs吸附剂萃取后的峰面积明显高于MWCNTs吸附剂处理和直接进样的峰面积。可能的原因有以下3点： 首先，混合酸处理后的MWCNTs表面有羟基和羧基，可与3种防腐剂表面的羧基、羟基或酯基形成氢键，因此，混合酸处理的MWCNTs对目标物有一定的富集效果； 其次，In2O3的引入使吸附剂表面具有丰富的羟基[19]，这些羟基可以进一步与目标防腐剂的特征官能基团形成氢键， 增强吸附能力。此外，负载了In2O3纳米粒子后，吸附材料具有大的比表面积，从而改善吸附剂对目标分析物的吸附效率。本方法的富集倍数尚有待提高。

3.3.3 In2O3MWCNTs吸附剂使用稳定性 为了考察In2O3MWCNTs吸附剂使用稳定性，使用一个批次内合成的5个不同的固相萃取小柱对3种防腐剂进行测定，批次内相对标准偏差为2.1%～4.5%； 使用5个不同批次合成的固相萃取小柱对3种防腐剂进行测定，批次间相对标准偏差为5.5%～7.9%。结果表明，该吸附剂稳定性较高。此外，In2O3MWCNTs吸附剂在连续使用的一个月内表现了较高的稳定性，对目标分析物的吸附效率没有发生明显变化。

3.4 实际样品分析

取当地超市购买的1种哈密瓜汁饮料、2种苹果醋饮料和3种葡萄酒各0.5 mL，用超纯水稀释至100 mL，制得样品储备液，经不同倍数稀释制成测试液。同时进行3种防腐剂加标回收率的测定，加标浓度水平分别为1 μg/mL和2 μg/mL。从图7中可见，葡萄酒3号实际样品溶液中检测到了部分分析物，所有待测物的色谱峰没有受到样品基质溶液的影响。加标回收率为70.3%～109.4%， 精密度在0.1%～6.6%范围内（表2），结果表明，本方法适用于饮料样品溶液中防腐剂含量的测定，可避免复杂样品基质的干扰。

4 结 论

本研究制备了In2O3MWCNTs新型纳米材料，并作为固相萃取吸附剂应用于SPEHPLC系统，检测饮料样品中苯甲酸、山梨酸和尼泊金甲酯的含量。 TEM、TGA、FTIR等表征方法及吸附实验表明该材料具有较多的吸附基团、良好的热稳定性和较高的萃取容量。在最优的实验条件下，评估了该样品前处理方法对3种防腐剂的富集能力和回收率，结果令人满意。

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Abstract In2O3 nanoparticlesmodified multiwalled carbon nanotubes （In2O3MWCNTs） were successfully prepared as solid phase extraciton （SPE） adsorbent for the determination of three food preservatives （benzoic acid， sorbic acid， and methylparaben） in beverage samples coupled with high performance liquid chromatography （HPLC）. Because of the large surface area and amount of hydroxyl groups on the surface of In2O3 nanoparticles， In2O3 nanoparticles could interact with specific functional groups. In2O3MWCNTs adsorbent was prepared based on the large surface area of In2O3 and superior thermal and chemical stability of MWCNTs. The obtained adsorbent was characterized via transmission electron microscope （TEM）， thermogravimetric analysis （TGA）， and Fourier transforminfrared （FTIR） spectroscopy. Several experimental parameters affecting the extraction efficiency were investigated by singlefactor experiments， such as adsorbents amount， sample volume， eluent volume， sample pH， and eluent type. The first four factors were then further evaluated by means of a Taguchi's L16 （44） orthogonal array experimental design. According to the results of orthogonal array experiment， the optimal conditions were chosen as follows： 0.15 g of adsorbent amount， 5.0 mL of sample volume， 0.6 mL of ACNH2O （60∶40， 0.1% formic acid， V/V） as eluent， and sample pH 4.0. Under the optimum conditions， the LODs （S/N=3） and LOQs （S/N=10） for three preservatives were in the range of 0.004-0.012 μg/mL and 0.012-0.038 μg/mL， respectively. The recoveries ranged from 70.2% to 109.4%. The method is rapid， sensitive， and suitable for the determination of preservatives in food samples.

Keywords Indium oxide nanoparticles； Multiwalled carbon nanotubes； Adsorbent； Food preservative

（Received 27 June 2017； accepted 22 November 2017）

This work was supported by the College Students' Innovative Training Program of Heilongjiang Province， China （No. 201710231049）.endprint