4种消毒剂对气单胞菌的抑菌杀菌效果研究

文/韦 艳 李传慰 祭仲石

本文以2016年本地区的一个生产周期为例，本实验室分离到的气单胞菌为实验对象，选择本地区水产养殖过程中常用的复合碘、苯扎溴铵、戊二醛和二硫氰基甲烷四种消毒剂为实验用消毒剂，采用二倍稀释法，检验各消毒剂的体外抑菌杀菌效果。结果表明，几种消毒剂中，抑菌杀菌效果依次为：二硫氰基甲烷＞苯扎溴铵＞ 复合碘＞戊二醛。通过本文的研究，以期为本地区淡水养殖找到合理高效的消毒剂提供依据。笔者就2016年度4种消毒剂对气单胞菌的体外抑菌杀菌效果研究的情况介绍如下，供大家参考。

气单胞菌属于γ－变形菌纲、气单胞菌目、气单胞菌科、气单胞菌属（Aeromonas），包括嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、温和气单胞菌（A.sobria）、豚鼠气单胞菌（A.caviae）、维氏气单胞菌（A.veronii）等20种。很多种气单胞菌是水产养殖中多种疾病的病原菌，在自然水体与养殖水体中广泛存在，在池塘水质恶化和养殖对象体质下降时，往往会加重疾病的诱发，给水产养殖带来重大损失。气单胞菌是一种重要的淡水养殖病原菌，可感染许多种水产动物，其中最严重的是以细菌性败血症为主，该病爆发迅速，一旦爆发往往造成巨大的损失。目前鱼类的细菌性疾病的治疗还是依靠内服抗生素，但是，抗生素的大量使用容易产生耐药菌株，同时抗生素在鱼体内残留也导致了食品安全问题。而化学类消毒剂在水产养殖中的广泛应用，可以有效的消灭病原微生物，起到了防治细菌性疾病的效果，且通常不会产生残留问题，因此寻找广谱、高效的外用消毒药物显得迫在眉睫，市场上消毒剂种类繁多，良莠不齐，选择合理的消毒剂可以有效减少盲目用药带来的损失，增加经济收益。

一、材料与方法

（一）材料

实验用消毒剂购自当地市场；培养基为脑心浸液培养基，p H（7.4±0.2），采购自OXOID；实验用气单胞菌菌株BY-1分离自当地患病鳊鱼。

（二）实验方法

1.细菌的分离与纯化

按无菌操作方法，分别取患病鳊鱼的肝脏、肾脏部位划线分离到脑心浸液培养基平板上，28℃恒温培养24h后，挑取优势菌落进行纯化，划线接种于脑心浸液培养基，28℃培养24h。

2.细菌悬浊液的制备

将分离到的致病菌接种于脑心浸液培养基上，置28℃培养箱中培养24h后挑选优势菌落纯化培养，然后经纯化培养后接种于斜面培养基，再次置于28℃培养箱培养24h后用0.7%的生理盐水洗下菌苔，制成细菌悬浊液为0.5麦氏单位备用。

3.4种消毒剂对气单胞菌最小抑菌浓度（MIC）测定

试验步骤：将4种消毒剂分别用蒸馏水稀释为1000mg/L的母液，然后用滤菌器将4种消毒剂滤菌，采用二倍稀释法，使液体培养基中4种消毒剂含量分别达到512mg/L、256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L。再分别接种100μL菌液浓度约为108CFU/mL的细菌悬浊液作为试验组；阳性对照将菌接种于不含4种消毒剂的脑心浸液液体培养基的试管中，阴性对照不加菌液。30℃培养24h，观察结果。通过细菌的是否生长，确定4种消毒剂抑制受试菌生长的最低浓度。

评定方法：当阳性对照管有细菌生长（浑浊），阴性对照管无细菌生长（澄清），试验组中无菌生长的最低4种消毒剂的浓度即为4种消毒剂对该供试菌株的MIC。

4.4种消毒剂对气单胞菌最小杀菌浓度（MBC）测定

试验步骤：根据最小抑菌浓度结果，分别选择高于MIC5个稀释度的试管中的培养液，取100μL菌液接种于相应的液体培养基中，同时添加阳性对照和阴性对照，30℃恒温条件下培养24h后，观察结果。

评定方法：当阳性对照管中有细菌生长（浑浊），阴性对照组无细菌生长（澄清），试验组无菌生长的最低稀释度所对应的消毒剂浓度为该样品对受试菌的MBC。

二、结果分析

（一）几种消毒剂的最小抑菌浓度（MIC）

肉眼观察无致病菌生长试管中的最低药物浓度，即为该供试药物的MIC。各菌株在含有不同浓度消毒剂的培养基中培养24h后观察结果，结果见表1。由表1中可以看出，阳性对照试管内出现浑浊，表示细菌增殖良好，阴性对照试管内澄清，表示没有细菌生长。实验组各试管出现浑浊和澄清现象，表明不同的消毒剂可以在不同浓度下抑制气单胞菌的生长。

从表1中可以得知各消毒剂对气单胞菌的最小抑菌浓度（MIC），其中二硫氰基甲烷在1mg/L时出现浑浊现象，表示在该浓度下不能抑制细菌生长，而在浓度2mg/L及以上浓度时出现透澄清现象，表明该浓度下细菌的生长被抑制，表明二硫氰基甲烷的最小抑菌浓度（MIC）是2mg/L。戊二醛在64mg/L及该浓度以下时均出现浑浊，表明在该浓度以及该浓度以下不能抑制细菌生长，而在浓度为128mg/L时及该浓度以上时均出现澄清现象，表明该浓度下细菌的生长被抑制，由此可得知，戊二醛的最小抑菌浓度（MIC）是128mg/L。同理可得出复合碘的最小抑菌浓度（MIC）是64mg/L，苯扎溴铵的最小抑菌浓度（MIC）是4mg/L。

以上几种消毒剂的MIC实验结果表明：二硫氰基甲烷在较低浓度下就可以有效抑制气单胞菌的生长，由此说明在养殖过程中，使用二硫氰基甲烷类消毒剂可以有效抑制致病菌的生长繁殖。

表1 4种消毒剂对气单胞菌的抑制作用

（二）几种消毒剂的最小杀菌浓度（MBC）

MBC即为供试药物杀灭99.9%或以上受试致病菌所需要的最低浓度。具体操作步骤是：在各消毒剂最小抑菌浓度实验的基础上进行测定，分别选择高于各消毒剂最小抑菌浓度的5个稀释度试管中的培养液，各取100μL菌液接种于对应的液体培养基中，30℃恒温条件下培养24h后观察结果。表2表明，各阳性对照菌出现浑浊，说明细菌可以生长繁殖；阴性对照出现澄清现象，说明阴性对照试管中没有细菌增殖；实验组各组试管中出现不同程度的浑浊或澄清。气单胞菌在二硫氰基甲烷浓度8mg/L以下时出现浑浊，说明二硫氰基甲烷在2mg/L～8mg/L时只抑制了气单胞菌的增殖，没有杀灭气单胞菌；气单胞菌在苯扎溴铵浓度32mg/L以下时出现浑浊，说明二苯扎溴铵在4mg/L～32mg/L时只抑制了气单胞菌的增殖，没有杀灭气单胞菌；气单胞菌在戊二醛512mg/L以下时出现浑浊，说明戊二醛在128mg/L～512mg/L时只抑制了气单胞菌的增殖，没有杀灭气单胞菌；气单胞菌在复合碘浓度512mg/L以下时出现浑浊，说明复合碘在64mg/L～512mg/L时只抑制了气单胞菌的增殖，没有杀灭气单胞菌。

嗜水气单胞菌

表2 4种消毒剂对气单胞菌的抑制作用

三、讨论

气单胞菌是水产养殖中常见的病原菌，是淡水养殖中细菌性败血症的主要病菌，快速准确的对其进行鉴定、筛选高效的消毒剂，对及时采取措施控制病情，指导养殖业科学用药，对实现水产动物健康养殖、保障食品安全具有重要意义。筛选高效的消毒剂，可以有效控制细菌性疾病，减少大量死亡带来的损失，增加养殖收入。本实验选择了4种常用的消毒剂进行研究，研究结果表明：4种消毒剂效果依次为：二硫氰基甲烷>苯扎溴铵>复合碘>戊二醛。二硫氰基甲烷对气单胞菌的抑菌效果最好，MIC为2mg/L，MBC为8mg/L，而戊二醛和复合碘效果相对较差。谭凤霞等研究表明，戊二醛在浓度为7.8mg/L 时对气单胞菌有有较好的抑菌效果，在相对高浓度的125mg/L的浓度下，对气单胞菌具有杀灭作用。谭凤霞等还研究表明，聚维酮碘对气单胞菌的MIC在125.00mg/L～250.00mg/L，MBC在4.00g/L～8.00g/L。本文结果表明，戊二醛MIC和MBC分别为128mg/L和大于512mg/L；复合碘MIC和MBC分别为64mg/L和大于512mg/L。本文结果与其他研究有些许不同，可能由于不同养殖区域惯用的消毒剂和环境不同，导致气单胞菌的耐药性不同，从而导致了不同地区气单胞菌的耐药性有所不同。

本文结果表明，二硫氰基甲烷在较低浓度下可以有效抑制和杀灭嗜水气单胞菌，其效果明显优于戊二醛、聚维酮碘等消毒剂。但不同地区的细致病菌存在不同的耐药性，且市场上消毒剂种类繁多，质量良莠不齐，选择合理的消毒剂可以有效减少盲目用药带来的损失，在今后的工作中，还要再进行同种类型消毒剂的横向比较，挑选最优药物。希望本文结果可以为水产养殖过程中使用消毒剂提供一定的参考。