DSA彩色编码技术在评估兔骨骼肌缺血再灌注损伤中的应用

李锦伟 张艳 张红 李承志 徐春雪 章文涛 李王海

急性动脉闭塞、肢体创伤、断肢再植等常可引起下肢的急性缺血，是临床常见的血管疾病之一，有较高的发病率和死亡率[1]，及时恢复肢体的血液灌注，避免肢体坏死是临床上解决这一问题的主要方法。然而观察发现，即使患肢恢复了血供，患者术后的肢体仍会面临着坏死及危及生命的风险[2]，这与缺血后再灌注损伤有着密切的关系。而骨骼肌对缺血非常敏感，缺血后再灌注不仅可以引起骨骼肌坏死，还可累及其他重要脏器，引起多器官功能障碍，甚至导致死亡[3]。

然而，在急性下肢缺血的治疗过程中，一旦闭塞的血管开通，组织恢复血液灌注后将引起不同程度的再灌注损伤，是影响患者预后的重要因素。因此，为了有效地预防和减轻缺血后再灌注损伤，需要在治疗过程中对肌肉组织的损伤程度进行及时和准确的评估。

因此，本实验拟通过建立兔后肢缺血后再灌注损伤的模型，对其进行后肢动脉的数字化减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA），并应用syngo iFlow彩色编码后处理软件分析DSA图像，计算出组织灌注相关的参数指标，结合实验室生化检查，探讨DSA彩色编码成像技术在评价骨骼肌缺血后再灌注损伤中的价值。

材料与方法

一、动物模型

30只健康新西兰大白兔购自暨南大学实验动物管理中心，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg，随机均分为对照组与缺血再灌注 0 h、6 h、12 h、24 h组，每组6只。腹腔内注射10%水合氯醛溶液（3～5 ml/kg）麻醉后，仰卧位固定，参考文献[4]建立兔下肢缺血再灌注模型，中下腹部剪毛备皮消毒，耻骨联合上取正中切口约3 cm，缺血再灌注各组完全暴露并缝扎右侧髂总、髂外、髂内、髂腰动脉，为防止尾动脉分支血管参与下肢骨骼肌供血，同时丝线捆扎尾巴，见右侧髂外动脉塌陷苍白、无搏动表示结扎成功，随后DSA造影证实未见右后肢动脉血流；作3 h右后肢骨骼肌缺血处理后，解除右侧髂总动脉缝扎，可见右后肢血管重新充盈并触及动脉搏动则再灌注成功，随后关闭腹腔，兔下肢缺血再灌注模型建立成功，分别按再灌注0 h、6 h、12 h、24 h分为4组后，进行双后肢脉造影；对照组仅作开、关腹及暴露血管，不作缺血及再灌注处理。实验严格遵守中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的标准对动物的进行处置[5]。

二、造影方法与图像后处理

缺血再灌注各组麻醉维持方法同前，颈部备皮后消毒铺巾。取颈部正中切口暴露一侧颈总动脉，以seldinger改良技术穿刺颈总动脉，送入微导丝及2.7F微导管，DSA透视导管送至腹主动脉中下段，以导管头端距离髂动脉分叉约3 cm为宜。行双后肢动脉造影方案为：西门子Artis Zeego血管造影机及工作站下，缺血再灌注各组及对照组以3 ml/s的流速经导管以高压注射（压力：200 PSI）注入，造影剂使用碘克沙醇（320 mgI/ml），总量 9 ml，采集帧率为6帧/s，每组均采集至下腔静脉显影。

将采集的DSA原始数据导入西门子Leonardo后处理工作站，使用syngo iFlow软件进行后处理得到彩色编码图像，从而得到时间密度曲线（time density curves，TDC）并提取出两个重要参数：最大增强值（Peak）及达峰时间（time to peak，TTP）。从TDC曲线中得到每个像素点的Peak和TTP，利用色度、饱和度、亮度（hue，saturation and value，HSV）色彩模型对上述参数进行彩色编码：饱和度（saturation）为常数，色度（hue）=TTP×240/360，亮度（value）=Peak，再利用公式将每个像素点的HSV值转化为红、绿、蓝等各种颜色，颜色的亮度变化代表不同造影剂的强化程度，而色彩的冷暖变化代表不同的造影剂达峰时间，从而在单幅彩色图像中显示整个DSA序列。

由2名从事介入诊疗的医师独立采集参数：分别在双侧大腿的股外侧肌区域对称地选取面积约50 mm2大小的感兴趣区（ROI），所选范围避开骨骼，从而获得并计算出右大腿最大强化值（PeakROIR），与左大腿最大强化值（PeakROI-L）的比值rPeak（rPeak＝PeakROI-R/PeakROI-L）。

三、实验室检查

完成实验组缺血再灌注处理后及对照组假手术处理后在一侧颈外静脉采集血液标本3 ml，所有血液标本常温静置30 min后，以3 000 r/min对血液标本作离心处理15 min后取上清液，置于-20℃冰箱内冻存，以备检测。采用全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）的含量；而超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD） 和 丙 二 醇（malondialdehyde，MDA）测定分别采用黄嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥钠法。实验试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）及检测仪器使用操作严格按照说明书进行。

四、统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，计量资料以±s表示，多组间的 rPeak、CK、LDH、MDA及SOD比较采用单因素方差分析，rPeak与CK、LDH、MDA、SOD生化指标的相关性分析采用Pearson相关；P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、各组的血清LDH、CK、MDA、SOD水平及rPeak比较

与对照组相比，再灌注各组的血清LDH、CK、MDA含量均升高，SOD降低差异有统计学意义（P<0.05）；随着再灌注时间的延长，血清LDH及CK含量逐渐升高。而再灌注各组间的MDA、SOD含量差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。与对照组相比，再灌注各组rPeak值均降低，且随着再灌注时间的延长逐渐下降，各组间差异均有统计学意义（P<0.05），见表 1。

二、rPeak与实验室指标的相关性分析

rPeak与LDH、CK、MDA之间均呈负相关（r分别为-0.885、-0.908、-0.541，均 P<0.05；），与 SOD 呈正相关（r=0.832，P<0.05），见图 1。

讨 论

缺血再灌注损伤的研究重心一直集中在心、肾、肝、脑、肺、肠等重要器官上[6]，但骨骼肌缺血再灌注损伤的检测及治疗同样是急慢性外周动脉闭塞后再通、断肢再植后所亟待解决的临床难题，当前骨骼肌缺血再灌注损伤并不少见，病死率高达18%[7-8]。

Labbe等[9]研究发现，在肌肉组织分别缺血3、4、5 h后，肌肉坏死的范围分别为2%、30%、90%。其观察发现肌肉的坏死在其中心部分更加严重，因此依靠外观来判断和评估骨骼肌的缺血再灌注损伤在临床上是不可靠的。骨骼肌肌肉组织中I型肌纤维以有氧代谢为主要能量来源，对缺血缺氧非常敏感，容易发生缺血性损伤；而II型肌纤维能量来源主要是糖的无氧代谢[10]，股外侧肌群以I型肌纤维为主，容易在缺血后发生再灌注损伤。缺血再灌注引起的微循环障碍导致组织血流灌注减少是造成再灌注损伤的重要原因，通过监测肌肉组织的灌注情况来评估其损伤程度是一种可行的方法。

据徐春雪等[11]研究，电子计算机断层扫描灌注成像（computed tomography perfusion imaging，CTPI）可早于形态学改变发现骨骼肌再灌注损伤情况，并可以较好地反映缺血再灌注损伤情况。但CTPI仅能在缺血再灌注发生后提供早期检测手段，不能对骨骼肌缺血再灌注损伤程度进行实时有效的监测，及时发现缺血再灌注损伤。为此，临床上需要一种更加客观、准确并实时有效的方法来对骨骼肌缺血再灌注损伤进行判断和评估。

表1 再灌注各组与对照组的血清LDH、CK、MDA、SOD水平及rPeak值比较 （±s）

表1 再灌注各组与对照组的血清LDH、CK、MDA、SOD水平及rPeak值比较 （±s）

注：IR为缺血再灌注；a为与对照组比较，P<0.05；b为与IR-0h组比较，P<0.05；c为与IR-6h组比较，P<0.05;d为与IR-12h组比较，P<0.05

分组对照组IR-0h组IR-6h组IR-12h组IR-24h组F值P值LDH（U/L）354.83±40.08 495.83±57.25a 1117.33±166.91ab 1574.33±238.20abc 2492.33±357.32abcd 104.54<0.05 CK（U/L）535.65±33.87 929.17±75.18a 4330.22±628.87ab 6636.88±395.55abc 10875.13±926.18abcd 391.54<0.05 MDA（nmol/ml）1.51±0.24 1.99±0.23a 2.11±0.28a 2.42±0.35a 3.07±0.60a 12.37<0.05 SOD（U/ml）173.54±5.47 165.79±3.78a 161.06±4.62a 153.14±4.72a 140.88±4.49a 43.34<0.05 rPeak 1.07±0.01 0.93±0.06a 0.79±0.05ab 0.65±0.04abc 0.47±0.04abcd 167.78<0.05

syngo iFlow是一种DSA图像后处理技术，它通过彩色编码算法，将对DSA图像的主观判断转化为客观的参数化指标[12]，使其能够量化地评估血流动力学状况以及组织灌注情况。研究发现，与普通DSA图像相比，彩色编码技术在单幅图像中对像素点进行颜色编码，将灌注情况参数化、彩色化，从而显示完整的血流灌注情况，使其具有可比性，增强图像的可视性，从而全面直观地显示了血管疾病的病变范围及程度[13]，对临床医师，特别是低年资临床医师诊断和评估脑血管疾病提供了很大的帮助。Su等[14]利用iFlow彩色编码血流成像技术评价严重下肢动脉缺血腔内治疗前后的循环变化，但并未对彩色编码血流图像及反映缺血再灌注损伤的参数进行进一步分析及讨论。

图1 iFlow彩色编码血管造影图

因此，本研究选取了双侧股外侧肌区域作为感兴趣区，利用彩色编码成像技术对DSA图像进行处理，分别得到右侧与左侧肌肉组织的Peak值。由于不同个体的参数绝对值相差很大，我们采用比较相对比值的方法，最大程度地消除个体差异对实验结果的影响。最后分别计算得出各组右后肢与左后肢Peak值的比值（rPeak）。研究结果显示，再灌注各组的rPeak值均较对照组有不同程度的降低，随着再灌注时间的延长，rPeak值逐渐下降，差异均有统计学意义。而rPeak与实验室各指标的相关性分析显示，rPeak与LDH、CK及MDA呈负相关，与SOD呈正相关。表明骨骼肌缺血再灌注过程中，iFlow的参数rPeak与实验室指标的变化一致，组织在恢复灌注的初期就发生了损伤，随着再灌注时间的延长，再灌注损伤的程度逐渐加重。

有研究通过观察大鼠的比目鱼骨骼肌缺血再灌注后的组织形态学发现[15]，在缺血4 h再灌注后24 h内，肌肉组织的损伤将逐渐加重，随着再灌注时间的延长，肌肉组织发生了更显著和严重的形态学变化，光镜下表现为细胞间质肿胀、剧烈的炎性浸润和肌纤维坏死，而在再灌注72 h后却表现为炎性浸润和纤维坏死减少，部分组织甚至出现再生的情况。这表明再灌注24 h的再灌注损伤最严重，本实验中，再灌注24 h的rPeak值为再灌注各组中最低，符合上述组织形态学变化趋势，可以认为rPeak值能够在一定程度上反映再灌注损伤的严重程度，这为iFlow参数量化评估缺血再灌注损伤提供了重要的证据。

综上所述，DSA图像不仅可以显示血管病变的部位、性质和范围等，还可以应用DSA彩色编码技术对图像进行后处理，计算并得到量化的参数指标rPeak，它与实验室生化检查都有着较好的相关性，而且rPeak值的变化趋势又符合缺血再灌注过程中组织形态学的改变特点。因此，在急性下肢缺血的介入治疗过程中，借助DSA彩色编码成像后处理技术可以在不增加手术步骤、X线剂量及造影剂用量的前提下，对骨骼肌组织的灌注变化进行实时有效的监测，及时发现缺血再灌注损伤，并量化地评估其再灌注损伤的严重程度，从而为术中的后续治疗策略和术后相关并发症的防治提供重要的参考和指导。

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