羟基红花黄色素A对高脂血症脂肪肝大鼠肝脏功能的干预作用＊

柴 文，付龙生，吕燕妮

(1、江西省人民医院神经内科，南昌 330006；2、南昌大学第一附属医院药学部，南昌 330006)

2016年《中国成人血脂异常防治指南》报道[1]，中国成人血脂异常总体患病率高达40%，以低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）或血清总胆固醇（TC）升高为特点的血脂异常是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要原因，血脂异常将导致2010年-2030年期间我国心血管病事件约增加920万，而肝脏是合成内源性胆固醇和脂质代谢的重要器官，血脂异常也容易造成肝脏的负担和功能异常。目前临床常用改善血脂异常的药物包括他汀类、烟酸类、贝特类等，但长期大剂量服用可能有潜在的肝脏功能损害等副作用。而以中医药理论为基础的中药活性成分，在高脂血症的治疗中具有其独特的优势。在2017年《红花黄色素临床应用中国专家共识》中明确HSYA具有调脂作用[2]，机制研究也提示HSYA可通过促进小鼠3T3-LI前脂肪细胞激素敏感脂肪增殖分化、减少前脂肪细胞数量、增强抗氧化能力达到降低血脂目的[3]。本试验以高脂血症脂肪肝大鼠为模型，通过给予不同剂量的HSYA，阐述HSYA对高脂血症脂肪肝大鼠肝脏功能的影响及其作用机制，为HSYA作为一种降脂护肝有效成分在中药的转化与转归中提供科学理论基础。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 羟基红花黄色素A购自江苏泽朗生物科技有限公司，纯度＞98%。胆固醇（中国医药集团上海化学试剂公司，AR级，批号F20030410），脱氧胆酸钠（北京双旋微生物培养基制品厂，批号20030617），丙硫氧嘧啶片（上海复星朝晖药业有限公司，批号030505），吐温80（蚌埠化学试剂厂，符合药用标准，批号20030602），1-2丙二醇 （淮南市化学试剂厂，AR级，批号20021020），猪油自制。天冬氨酸转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、天冬氨酸转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、 丙 二 醛 （Malondialdehyde，MDA)，过氧化氢酶（HydrogenPeroxidase，CAT）测试盒和油红O染液均购自南京建成生物工程研究所。阿托伐他汀钙片（规格：20mg，商品名：立普妥，批号2EZPA16001)购自辉瑞公司。雄性Spague-Daw lay SD 大鼠，清洁级，体重 180～200g，72 只，合格证号SCXK（20080033浙），由扬州大学比较医学中心提供。

1.2 实验动物分组及处理 72只SD大鼠随机分为6组，每组12只。设正常对照组、高脂血症脂肪肝模型组、HSYA 低、中、高剂量组（2、4、8mg/kg）、阿托伐他汀钙片组（3mg/kg）。除正常对照组外，其余各组动物均给予脂肪乳剂，脂肪乳剂制备方法按照文献[3]报道。高脂血症脂肪肝模型，给予每天10ml/kg灌胃，连续2周，阿托伐他汀钙片组及HSYA低、中、高剂量组，各给药组灌胃给予相应的药物，同样连续给药2周。同时正常对照组、高脂血症脂肪肝模型组灌胃给予同等体积的生理盐水。实验之前，禁食禁水12h，处死灌洗后迅速取肝脏组织，并在-70℃冰箱保存，测定肝脏组织中AST、ALT、SOD、MDA 和 CAT 水平，观察肝脏形态和western blot实验。

1.3 观察指标测定 大鼠新鲜肝脏组织经生理盐水简单灌洗后，加入组织裂解液在冰水中制成匀浆，4℃ 4，000r/min 离心 10min，提取上清液，肝脏生化指标均按试剂盒规范操作测定。

1.4 肝脏形态学检测 用于肝脏形态学观察的大鼠，每组取6只大鼠，使用100g/L水合氯醛深麻醉下处死，取肝脏组织，并生理盐水简单灌洗，直到灌洗液无明显红色为止，再用40g/L多聚甲醛灌注，直至流出液体为淡红色或透明色。切下的肝脏小块在4℃40g/L多聚甲醛溶液中固定24h后，脱水进行石蜡包埋，切片5μm，常规HE染色。或经处理的肝脏切片，用60%异丙醇漂洗约30s，充分甩干约20s，用60%油红O上层液染片约5-10s漂洗掉多余染液，甘油明胶固定封片，光学显微镜下观察肝脏形态，考察各组肝脂肪变性程度。

1.5 Western blot法检测肝脏相关蛋白水平 将取得的大鼠肝脏加细胞裂解液匀浆离心后取蛋白，BCA定量蛋白剂量40μg上样，采用10%的SDSPAGE分离蛋白，转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2h后，加1：1000稀释大鼠抗高脂血症组固醇调节元件结合蛋白-2（Sterol-regulatory elementbinding protein，SREBP-2）SREBP-2 抗体、 大鼠抗LDL（LDL receptor，LDL-R）LDL-R 抗体、大鼠抗羟甲基戊二酰辅酶A还原酶 （3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）HMGCR 抗体、大鼠抗脂肪酸合成酶 （Fatty acid synthetase，FAS）FAS抗体和大鼠抗β-actin抗体，4℃过夜。漂洗后加辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠动物抗体（1：1000）， 室温孵育 50min，ECL 法显色，Bio-Rad公司生物图像分析系统捕获。

1.6 统计学处理 所有数据采用（mean±SD）表示，对于两组间的比较用Students’t检验，当3组或3组以上比较时用单因素方差分析，后检验采用Students’t，P＜0.05 认为有统计学意义。

2 结果

2.1 对肝功能指标的影响 与正常对照组比较，高脂血症脂肪肝组肝脏中AST、ALT和MDA显著升高，SOD、CAT明显下降，有统计学差异，提示造模成功。各剂量HSYA给药组均能显著降低肝脏中AST、ALT和MDA水平，并同时升高SOD、CAT水平，且呈剂量依赖性，提示HSYA对高脂血症损伤肝功能的生化指标有改善作用。

2.2 对肝脏病理组织的比较 正常对照组大鼠肝细胞排列规则，肝细胞呈多边形，胞浆均匀，细胞核形态正常。与正常对照组比较，高脂血症组脂肪肝组出现不同程度的脂肪变性和空泡样变及纤维化明显，变性的肝细胞多为圆形，体积增大，肝细胞形态改变。给予HSYA后，高脂血症脂肪肝组脂肪变性程度及细胞肿胀减轻，空泡变少，肝细胞的体积大小有所恢复，且呈剂量依赖性。

2.3 对肝脏病理组织脂滴形成的比较 正常对照组肝细胞结构完整，未见红色脂滴，高脂血症脂肪肝模型组，肝细胞可见大小不等的红色脂滴，给予HSYA后，高脂血症脂肪肝组肝细胞内红色脂滴观察到均有不同程度地减少，改变呈剂量依赖性。

2.4 对肝脏相关蛋白表达 高脂血症脂肪肝组大鼠肝脏SREBP-2、LDL-R、HMGCR和FAS表达与正常对照组比较表达降低。与高脂血症脂肪肝组比较，给予 HSYA干预后，SREBP-2、LDL-R，HMGCR和FAS蛋白显著升高，且低中剂量HSYA对大鼠肝脏SREBP-2、LDL-R，HMGCR和FAS蛋白升高的效果更佳明显。

表1 HSYA对高脂血症脂肪肝大鼠肝脏AST、ALT、SOD、MDA和CAT的影响

表1 HSYA对高脂血症脂肪肝大鼠肝脏AST、ALT、SOD、MDA和CAT的影响

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

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表2HSYA干预后高脂血症脂肪肝大鼠肝脏中相关蛋白的表达

3 讨论

《药品化义》中认为红花善通利经脉，为血中气药，现代分析技术表明HSYA是红花药理功效的最有效水溶性部位的主要有效成分。本研究中所用的高脂血症脂肪肝模型[4]，是基于高脂血症致脂肪肝病变的一种，在发生高脂血症后，由于肝细胞转运胆固醇能力下降、或相应LDL受体减少等机制而产生，此模型可代表血脂高后的肝脏功能异常，在研究血脂相关疾病方面具有代表性。本实验研究结果表明，HSYA对高脂血症肝脏形态及功能指标有改善作用，提示HSYA有调节血脂、胆固醇代谢和保护肝脏的作用。靳宏光等[5]报道，羟基红花黄色素A可降低高脂饲料喂养的兔模型中血清TC、LDL-C及MDA，减少颈动脉粥样硬化斑块数量和面积，通过降低血脂和增强抗氧化作用以治疗动脉粥样硬化。王艺蓉等[6]报道在四氯化碳诱导肝纤维化大鼠中，HSYA对肝组织中转化生长因子-β1有抑制作用，可减轻水肿程度，抑制纤维化，促进肝损伤修复。并且在本实验有效剂量上，HSYA对肝功能损伤在50、100、150mg/kg间出现明显的剂量-效应关系，相对于阿托伐他汀钙片，具有起效早、作用稳定、强效的特点，可有效对血脂脂肪肝进行调节。

临床常规检验提供的血脂参数包括TC、HDLC、LDL-C、VLDL-C与TG。流行病学与观察性研究发现，LDL-C水平与ASCVD的发病风险密切相关，LDL是致动脉粥样硬化病变的基本因素。基础研究发现，LDL通过血管内皮进人血管壁内，在内皮下滞留的LDL被修饰成氧化型LDL，继而被巨噬细胞吞噬后形成泡沫细胞，不断增多融合的泡沫细胞，构成动脉粥样硬化斑块的脂质核心[7，8]。另外HDL-C与TG水平与ASCVD的发病也存在相关性[9]，HDL-C水平降低和或TG水平增高的人群中，专家仍建议以LDL-C为干预血脂异常的主要靶点，力争将HDL-C和TG控制于理想范围（HDL-C≥1.04mmol/L，TG＜1.7mmol/L）。 目前临床常用的调节血脂药物，他汀类药物[10]可有效降低LDL-C，但升高HDL-C作用有限，仅能升高5%-15%。贝特类和烟酸类药物升高HDL-C作用强于他汀类药物，可使HDL-C升高10%-35%[11]，本实验研究结果表明HSYA不仅具有降低TC、LDL-C与TG的作用，还具有升HDL-C的作用，有很好的应用价值。

高脂血症肝脏的病理结果显示，当血脂及胆固醇含量增加时，SREBP-2、LDL-R、HMGCR、FAS相关蛋白表达量增高，从形态学上可见加重肝脏的病理变化。固醇调节元件结合蛋白 （sterolregulatory element-binding proteins，SREBPs） 是脂质代谢的重要转录因子，包括两种异构体SREBP-1和SREBP-2，可调控脂肪酸和胆固醇的合成[12]，其中有报道SREBP-2可直接影响细胞膜上TC代谢水平，作为一种特异的核转录因子主要参与TC合成酶的基因调控，在TC含量降低的情况下，增进HMG-CoA还原酶、LDL受体等靶基因的表达，从而升高细胞内TC水平[13]。LDL-R位于肝脏表面，其能够与多种结构及功能各异的配体相互作用，对血脂的动态平衡及纤溶功能的稳定进行调节，介导血浆中LDL-C的含量、调节血浆含量和体内TC的水平[14]。HMG-CoA还原酶在HMG-CoA的催化作用下，经过一系列催化、转化作用能够抑制肝内胆固醇合成速度，减少或阻断体内胆固醇合成，从而对高脂血症进行治疗，现在临床所用的他汀类药物如阿托伐他汀钙片、氟伐他汀片、辛伐他汀片均为HMG-CoA还原酶抑制剂药物，已成为治疗高脂血症的主要药物。脂肪酸合酶FAS是肝脏脂代谢关键因子，参与调节脂肪酸合成酶的合成[15]，减少FAS的合成对减少脂肪酸的合成有重要作用。以上4种蛋白均参与血脂和胆固醇调节，而其中SREBP-2可作用调控和影响LDL-R，HMGCR和FAS基因的转录因子，诱导下游脂质异常的发生和发展。

血脂的调节机制涵括减少外源性吸收、抑制内源性合成和促进内源性转化等多个方面，目前关于HSYA调节血脂的机制研究相对局限，本研究针对其抑制内源性合成和肝脏保护方面进行研究，然而其更丰富的机制仍需探索。本研究通过构建高脂血症脂肪肝大鼠模型，从肝脏功能指标通路探讨高脂血症脂肪肝大鼠肝功能异常特点，同时表明HSYA可抑制血清血脂指标异常，并对肝脏功能具有保护作用，更深入的机制研究仍有待于进一步探索。

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