党参对压力负荷致心衰小鼠电生理重构的影响

，， ， ， ，

心力衰竭(HF)是各种结构改变或功能减退的心脏疾病导致心室充盈及(或)射血能力受损而引起的一组复杂的临床综合征[1]。据统计，发达国家1%～2%的成年人患有HF，70岁以上的人群中HF发病率可高达10%[2]。大约有50%的HF病人在诊断后5年内死亡[3]，其中有50%的死亡原因是心源性猝死[4]。电生理重构导致的恶性心律失常是HF病人死亡的重要原因之一[5]。电生理重构是指在HF时，由于心肌细胞病理生理机制发生变化，而改变其电冲动的产生及传导[6]。目前，临床上仍缺少针对HF电生理重构的有效药物。中医认为，气虚血瘀水停是HF的基本病机，而气虚贯穿HF发展始终[7]，党参是临床防治HF常用的益气药。本实验通过使用党参干预压力负荷导致HF小鼠，观察党参对HF小鼠电生理重构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠25 g±5 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2012- 0001，饲养于中国中医科学院中药研究所动物房，每天定时喂食、喂水并清洁动物房。

1.2 实验药物及配制溶液 中药党参颗粒制剂，购自北京中医药大学东方医院；酒石酸美托洛尔(倍他乐克)：阿斯利康制药有限公司，生产批号：1209047；水合氯酸为国产分析纯试剂；咖啡因；丁卡因；配制溶液：台氏液，KB液，消化液，0Ca/0Na台式液，30%丙烯酰胺溶液，4×分离胶缓冲液(1.5M Tris- HCl，pH 8.8，200 mL)，4×积层胶缓冲液(0.5M Tris- HCl，pH6.8，50 mL)，10%过硫酸铵，10×电泳缓冲液，染色液，脱色液，丽春红染液，10×PBS，转膜缓冲液，5%封闭液。

1.3 实验仪器 单细胞动缘探测系统(IonOptix，USA)，电子刺激器 SEN 27103 (IonOptix，USA)，小动物超声心动检测系统(Vevo770 ultrasound system，Visual Sonics Inc，USA)，心电检测平台ecgTUNNEL(EMKA Technologies，France)，Langendorff心脏灌流系统，微电极B15014F(微探科学仪器有限公司)等。

1.4 缩窄小鼠胸主动脉动物造模 对麻醉后的小鼠于胸骨正中线处剪开皮肤，切口(0.5～1) cm，钝性剥离肌肉。暴露主动脉弓胸主动脉分支处，将28- gauge注射器针头平行放置于胸主动脉上，用4号聚丙烯缝线将针头和主动脉结扎。假手术不结扎胸主动脉，其余步骤同模型组。

1.5 实验干预 将手术成功后存活的小鼠随机分为模型组、党参组、西药组，每组12只，常规喂养3 d后灌胃给药。各组灌胃总量均为20 ml/kg，共灌胃4周。假手术组和模型组给予生理盐水灌胃；党参组给予党参6 g/(kg·d)灌胃；西药组给予酒石酸美托洛尔10 mg(kg·d)灌胃。

1.6 超声心动检测小鼠收缩和舒张功能 测量左室射血分数(LVEF)、左室短轴收缩率(LVFS)，评价心脏收缩功能；测量舒张早期二尖瓣口血流速度(E)和舒张早期室间隔运动速度(Ea)，并计算E/Ea，评价心脏舒张功能。各参数连续测量3个心动周期，计算平均值。

1.7 心电图检测 使用ecgTUNNEL心电检测平台，检测清醒状态下6导联体表心电图。每只小鼠在记录前适应5 min后开始记录20 min，使用IOX软件(EMKA Technologies，France)记录。使用ECGAuto软件(EMKA Technologies，France)进行分析，按参考文献[8]设定心电图分析模板，分析QT间期以及校正QT间期(corrected Q- T interval，QTc)。

1.8 钙瞬变 心室肌细胞急性分离，各组小鼠在干预4周检测心功能后，取出一段带有主动脉的心脏，通过Langendorff装置上消化，最后使细胞保存在正常的含钙台式液(1.2 mmol/L Ca2+)备用。 钙漏和钙库的检测，选取横纹清晰、收缩稳定、边界清楚的长杆状细胞，利用IonOptix单细胞动缘检测系统测定细胞功能。检测心肌细胞肌浆网钙漏、钙库。

1.9 全细胞膜片钳技术 细胞稳定10 min后，给予1.5倍阈上刺激的电流(时程3 ms～5 ms)以诱发动作电位，刺激频率为0.2 Hz或2.0 Hz，记录动作电位，分析动作电位复极90%时间(APD90)。

1.10 Western Blot检测 运用Western Blot检测干预后各组SERCA、PLB、CAMK蛋白水平及活性。对总蛋白进行提取、浓度测定、制备相应浓度的分离胶及浓缩胶，并进行分离与浓缩，在浓缩胶聚合的过程中，将样品与适量蛋白上样缓冲液充分混匀，加热使蛋白变性，待浓缩胶聚合完全，把凝胶固定于垂直电泳装置上，槽内加入甘氨酸电泳缓冲液，将变性后的蛋白样品和预染蛋白Marker小心地加入上样槽进行电泳，调整电压，电泳直至溴酚蓝至分离胶底部时停止，凝胶用适量转膜缓冲液平衡后即可进行转膜，免疫反应后进行ECL显影，使用软件进行蛋白印迹分析，检测相应蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 小鼠存活情况 术后4周模型组小鼠死亡3只，假手术组无小鼠死亡，党参组小鼠死亡3只，西药组小鼠死亡5只。

2.2 小鼠心脏功能 与假手术组相比，模型组LVEF、FS显著降低，E/Ea显著升高(P<0.01)，表明压力负荷增加导致小鼠HF。与模型组相比，党参组LVEF、FS显著提高(P<0.01)，表明党参可改善HF小鼠心脏收缩功能，而西药对心功能舒缩功能改善均不明显。详见表1。左室短轴切面和M型超声详见图1。

表1 党参对HF小鼠左室功能的影响(±s)

图1左室短轴切面和M型超声

2.3 电生理重构

2.3.1 QT间期、校正QT间期 与假手术组相比，模型组QT间期、QTc均显著延长(P<0.01)，表明压力负荷导致了小鼠电生理重构。与模型组相比，党参组小鼠QTc缩短(P<0.01)，说明党参可改善电生理重构，而西药组心电参数改善不明显。详见表2。

表2 党参对HF小鼠QT间期、QTc的影响(±s)

2.3.2 细胞动作电位复极90%时间(APD90) 模型组与假手术组相比，在0.2 Hz、2.0 Hz频率刺激下心肌细胞APD90均显著延长(P<0.01)；党参组与模型组相比，在0.2 Hz、2.0 Hz频率刺激下心肌细胞APD90显著缩短(P<0.01)；西药组与模型组相比，APD90无统计学意义。提示党参可改善电生理重构，而西药组无明显改善作用。详见表3。

表3 党参对HF小鼠0.2 Hz、2.0 Hz频率刺激下心肌细胞APD90的影响(±s) ms

2.4 钙漏和钙库 与假手术组相比，模型组钙渗漏显著增加(P<0.01)，基线水平和钙库容量差异无统计学意义。与模型组相比，党参组钙漏减小(P<0.05)，说明党参可抑制肌浆网钙漏，而西药组对肌浆网钙漏的无明显抑制作用。详见表4。钙漏和钙库的测量详见图2。

表4 党参对HF小鼠心肌细胞钙漏和钙库的影响(±s)

图2钙漏和钙库的测量

2.5 钙循环相关蛋白表达含量 与假手术相比，模型组SERCA、PLB及其比值无明显变化，而CAMK表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，党参组CAMK表达含量降低(P<0.05)。详见表5、图3～图5。

表5 钙循环相关蛋白表达含量(±s)

图3 SERCA表达含量

图4 PLB表达含量

图5 CAMKⅡ表达含量

3 讨 论

近几十年中医在HF辨证防治方面做了大量的研究工作，现较为统一完整的认识是，HF病机概括为本虚标实，即在气虚、阳虚之人体正虚的基础上存在血瘀、水饮、痰饮等实邪。郭维琴指出气虚血瘀是HF最根本的病机，亦体现本虚标实是HF之根本，气虚血瘀和阳虚水泛为基本病机[9]。邓铁涛认为[10]，就HF病机而言，依然可以认为是经典的本虚标实，本为心之阳气亏虚或兼以心阴亏虚，标为瘀血兼以水停。陈可冀用“虚”“瘀”“水”三个字高度概括HF发生发展的病机[11]。林谦等[12]研究提示HF在发生发展变化过程中最常见的证候是气虚血瘀水停，并在中医气血理论基础的指导下，结合自身临床经验，首创了具有针对性的“益气活血利水”方，对于改善病人临床症状、提高生活质量、改善心功能等多方面疗效显著。

党参作为补益药物最早见于清朝吴仪洛《本草从新》[13]。现代研究表明党参中富含皂苷和微量生物碱等多种化学成分，具有补中益气等功效[14]。王硕仁等[15]研究发现服用党参提取液可明显提高左室舒张期E波峰值和左房室间压力阶差，显著缩短左室舒张早期充盈时间，明显增加左室收缩功能的心输出量；同时，党参可明显提高小白鼠心肌糖原、琥珀酸脱氢酶的含量，成为党参改善心肌能量代谢、补气强心作用的机制之一。

电生理重构导致的恶性心律失常是HF病人死亡的重要原因之一，严重影响HF病人的预后[16]。电生理重构在HF时，病理生理机制变化，导致心肌细胞的电活动发生异常，其最重要的表现为获得性QT间期、APD延长，这与心肌细胞除极、复极速度不同步有关[17]。本实验研究结果表明，在缩窄胸主动脉4周后，小鼠LVEF、LVFS均下降，说明压力负荷致HF造模成功；QT间期、APD延长，出现了电生理重构。党参组可缩短QTc和APD90，疗效优于西药(倍他乐克)组，说明党参对电生理重构有一定改善作用。

在兴奋- 收缩耦联过程中，钙库内钙离子经肌浆网上雷尼丁受体(RyR2)释放入细胞质中，与横桥结合，细胞收缩；舒张期时由肌浆网上钙转运蛋白(SERCA2a)及其调节蛋白受磷蛋白(phospholamban，PLB)将钙离子运回钙库内[18]。在HF心肌细胞中，RyR2稳定性降低，舒张期钙通道异常开放，在舒张期发生钙离子的释放，形成产生钙渗漏[19- 20]。舒张期钙离子的异常释放，能激活Na/Ca通道，影响心肌细胞的复极，引发后除极。在某些严重的情况下，可诱发严重的恶性室性心律失常，最终导致心源性猝死[21- 22]。而本实验中，党参可明显抑制钙漏，可能与抑制CAMKⅡ表达有关，而倍他乐克无此效果。细胞质内钙离子含量及钙库含量无明显变化，可能与SERCA2a、PLB功能不受影响有关。

本实验研究表明，党参可改善压力负荷导致HF小鼠电生理重构，可能与通过抑制CAMKⅡ表达，抑制肌浆网钙漏有关。

[1] 中华医学会心血管病学分会，中华心血管病杂志编辑委员会.中国心力衰竭诊断和治疗指南2014[J].中华心血管病杂志，2014，42(2)：98- 122.

[2] Ponikowski Pl，Voors AA，Anker SD，et al.2016 ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure： the task force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure of the European Society of Cardiology(ESC)Developed with the special contribution of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC[J].Eur Heart J，2016，37(27)：2029- 2200.

[3] Mozaffarian D，Benjamin EJ，Go AS，et al.Heart disease and stroke statistics- 2016 update： a report from the American Heart Association[J].Circulation，2016，133(4)：e38- e360.

[4] Urso C，Canino B，Brucculeri S，et al.Analysis of electrolyte abnormalities and the mechanisms leading to arrhythmias in heart failure.a literature review[J].Clin Ter，2016，167(4)：e85- e91.

[5] Gomez JF，Cardona K，Romero L，et al.Electrophysiological and structuralremodelingin heart failure modulate arrhythmogenesis.1D simulation study[J].PLoS One，2014，9(9)：e106602.

[6] Coronel R，Wilders R，Verkerk AO，et al.Electrophysiological changes in heart failure and their implications for arrhythmogenesis[J].Biochim Biophys Acta，2013，1832(12)：2432- 2441.

[7] 苏敬泽，李乐文，林谦.林谦中西医结合治疗慢性心力衰竭经验总结[J].中国中医基础医学杂志，2016，22(1)：128- 130.

[8] van Oort RJ，McCauley MD，Dixit SS，et al.Ryanodine receptor posphorylation by Calcium/Calmodulin dependent protein kinase Ⅱ promotes life- threatening ventricular arrhythmias in mice with heart failure[J].Circulation，2010，122(25)：2669- 2679.

[9] 王亚红，王振涛.郭维琴教授对心力衰竭的中医认识与辨治[J].河南中医，2003，23 (10)：12- 13.

[10] 葛鸿庆，赵粱，郝李敏.邓铁涛教授从脾论治慢性充血性心力衰竭之经验[J].上海中医药杂志，2002，36(4)：9- 10.

[11] 李立志.陈可冀治疗充血性心力衰竭经验[J].中西医结合心脑血管病杂志，2006，4(2)：136- 138.

[12] 林谦，霍艳明，郭维琴，等.心气虚证中医辨证规律的临床研究[J].中西医结合杂志，1990，10(2)：78- 81.

[13] 季晓，宣槐斌，黄宝康.明党参活性成分及药理作用研究进展[J].药学实践杂志，2015，33(2)：102- 105；137.

[14] 郭立忠.补益药党参的药理作用与临床应用研究[J].中国卫生标准管理，2015，6(22)：130- 131.

[15] 王硕仁，徐西，林谦，等.党参益气强心、活血化淤作用的研究[J].中药药理与临床，1994(1)：32- 37.

[16] Yancy CW，Jessup M，Bozkurt B，et al.2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart failure： a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on practice guidelines[J].Circulation，2013，128(16)：e240- 327.

[17] Wang Y，Tandan S，Cheng J，et al.Ca2+/calmodulin- dependent protein kinase Ⅱ- dependent remodeling of Ca2+current in pressure overload heart failure[J].J Biol Chem，2008，283(37)：25524- 25532.

[18] 郭继鸿.心力衰竭的电重构[J].临床心电学杂志，2011，20(1)： 61- 72.

[19] Ono K，Yano M，Ohkusa T，et al.Altered interaction of FKBP12.6 with ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca2+release in heart failure [J].Cardiovasc Res，2000，48(2)： 323 - 331.

[20] Reiken S，Gaburjakova M，Guatimosim S，et al.Protein kinase A phosphorylation of the cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) in normal and failing hearts[J].J Biol Chem，2003，278(1)： 444 - 453.

[21] Most P，Koch WJ.Sealing the leak，healing the heart [J].Nat Med，2003，9(8)： 993 - 994.

[22] Marks AR.Ryanodine receptors /calcium release channels in heart failure and sudden cardiac death [J].Mol Cell Cardiol，2001，33(4)： 615 - 624.