气相色谱-串联质谱法测定水果、蔬菜中三唑锡、三环锡和苯丁锡的残留量

朱萌萌，黄亮，周敏，陈卢涛，俞璐萍，胡松，胡晋峰，王川丕*

1(绿城农科检测技术有限公司，浙江 杭州，310000) 2(安徽农业大学/茶与食品科技学院/茶叶生物与利用国家重点实验室，安徽 合肥，230036)

有机锡化合物(organotin，OT)是20世纪50年代开发的农药，按用途可分为杀菌剂、杀虫剂和杀螨剂等[1-2]。近年来，有机锡化合物以其高效、低毒的特性而用量逐年增加，但由于其潜在的毒性和对非目标生物的影响，越来越引起人们的重视。日本肯定列表制度于2006年规定所有食品中不得检出三唑锡和三环锡[3]；欧盟规定三唑锡、三环锡(以三环锡总和计)在水果、蔬菜、动物产品、牛奶、鸡蛋中的最大残留限量为0.01 mg/kg、规定苯丁锡在蔬菜、谷物、动物产品、牛奶、鸡蛋中的最大残留限量为0.01 mg/kg[4]；我国《GB 2763—2014食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定三唑锡在橙、柚、柠檬、梨水果中的最大残留限量为0.2 mg/kg，三环锡在橙中的最大残留限量为0.2 mg/kg、苯丁锡在黄瓜中的最大残留限量为0.5 mg/kg。

目前国内外有机锡类农药的检测分析方法主要包括气相色谱法(GC-FPD)[5]、气相色谱质谱法GC-MS[6-7]、液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP/MS)[8]等。因有机锡化合物沸点高，不能直接用于气相色谱法的分析，需要先将其进行衍生化反应，最常见的衍生化方法主要有采用各种格林试剂烷基化[9-13]；采用四乙基硼化钠直接在水溶液中进行衍生化[14-18]；采用硼氢化钠在酸性环境下将有机锡转化为相应的氢化物[19]等。采用格林试剂进行烷基化反应，这一方法操作比较繁琐、耗时，而且需要严格的无水条件、不带活泼氢离子的非极性溶剂[20]。近年来，采用四乙基硼化钠直接在水溶液中进行衍生的方法得到越来越多的应用。本文拟采用优化后的萃取、净化、衍生等前处理方法结合GC-MS/MS方法，探讨2种衍生化试剂用于果蔬中三唑锡、三环锡和苯丁锡3种有机锡化合物残留量分析的差异，旨在探究一种操作简单、检出限低、灵敏度高的前处理及衍生化方法，用于果蔬中痕量有机锡化合物残留量的检测分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三环锡标准品(纯度≥99.0%)，德国Dr.Ehrenstorfer公司；苯丁锡标准品(纯度≥98.5%)，德国Dr.Ehrenstorfer公司；三唑锡标准品(纯度≥98.5%)，上海市农药研究所有限公司；乙基溴化镁乙醚溶液(3.0 mol/L), 默克Sigma-Aldrich中国公司；四乙基硼化钠(2%水溶液，取0.2 mg溶解到10.0 mL去离子水)，美国Strem公司；四氢呋喃、乙腈、丙酮、二氯甲烷(色谱纯)，美国J.T.Baker公司；甲苯、HCl、H2SO4(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；试验室所用水均为去离子水；微孔有机滤膜(0.22 μm)。

1.2 仪器与设备

气相色谱-串联质谱仪(GC-2010 plus气相色谱仪配TQ8040质谱仪，VF-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm))，日本Shimadzu公司；ST-16R 离心机，美国Thermo Fisher公司；BSA2202S电子天平，德国Sartorius公司；漩涡混合器，美国Henry Troemner 公司；旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；Cleanert Florisi弗罗里硅土固相萃取柱(500 mg/6 mL)，天津博纳艾杰尔科技有限公司；KQ5200E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MTN-5800氮吹仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；CHK-121台式精密酸度计：北京昌科仪自动化科技有限公司。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件

进样口温度：250 ℃ ；载气：高纯氦气；碰撞气：高纯氩气，纯度≥99.999%；柱流量：1.0 mL/min；进样方式：不分流进样，1.0 min后开阀；进样量：1 μL；定量方法：外标法；升温程序：60 ℃保持1 min，以40 ℃/min升至170 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至290 ℃，保持4.25 min；

1.3.2 质谱条件

色谱-质谱接口温度：280 ℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；检测器电压：0.99 kV(+0.4kV)；测定方式：MRM多重反应监测模式；定性、定量离子、碰撞能量等参数见表1。

1.4 试验步骤

1.4.1 提取

称取5.00 g(精确至0.01 g)蔬菜或水果样品于50 mL离心管中，加入5.0 mL一定pH的纯净水(使用体积比为1∶1为盐酸水溶液调节pH)浸泡0.5 h，加入10.0 mL正己烷，涡旋器振荡1.0 min，超声提取20 min，在5000 r/min下离心3.0 min，取上清液于鸡心瓶中，残渣再次加入正己烷10.0 mL超声提取一次，合并提取液，于30 ℃水浴中减压浓缩至近干，在常温条件下，氮气流缓缓吹干有机溶剂，待衍生。

表1 三唑锡、三环锡和苯丁锡质谱检测参数

注：*表示定量离子。

1.4.2 衍生化

(1)向上述提取液中加入衍生化试剂3.0 mol/L的乙基溴化镁乙醚溶液1.5 mL，盖上瓶塞，涡旋并超声15 min，然后在冷水浴中逐滴加入1.0 mL 0.5 mol/L的稀硫酸溶液，并不断振荡，静置后取上清液，待净化。乙基溴化镁乙醚溶液遇水剧烈反应，并产生大量热，此过程应小心操作，保持无水环境且稀硫酸应在冷水浴中逐滴加入。

(2)向上述提取液中加入衍生化试剂2%的四乙基硼化钠水溶液0.5 mL，盖上瓶塞，涡旋并超声15 min，加入2.0 mL正己烷提取衍生后产物，涡旋后离心取上清液，待净化。

1.4.3 净化

先用5.0 mL正己烷预淋洗Florisil固相萃取柱，将上述待净化液转移至小柱上，再用10.0 mL正己烷-丙酮(体积比为99∶1)溶液进行洗脱，收集全部流出液，在常温条件下氮气流吹至近干，用正己烷溶解并定容至1.0 mL，供气相色谱-串联质谱检测。

1.4.4 标准溶液的配制

称取三唑锡、三环锡和苯丁锡0.010 0 g，用色谱纯二氯甲烷定容至25.0 mL，分别得到约107、122、44.4 mg/L标准储备溶液(以Sn计)；用二氯甲烷稀释为10.0 mg/L的标准工作溶液，于0～4 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 气相色谱-质谱条件的优化

在电子轰击离子源(EI)检测模式下对三唑锡、三环锡和苯丁锡进行一级质谱分析(Q3 Scan)，三唑锡在环境中水解为三环锡[16]，故三唑锡的仪器条件优化同三环锡。在质谱图中选择质荷比较大，绝对强度较大的离子为前体离子；设定3～45 eV(每3 eV一个间隔)的碰撞能量，对选定的前体离子峰进行二级质谱分析(产物离子扫描)，根据二级质谱图，选择离子强度最大的为定量离子，离子强度次之的为定性离子。图1为使用优化后的气相色谱质谱条件采集三唑锡(154 μg/L)、三环锡(136 μg/L)和苯丁锡(56.4 μg/L，以Sn计)标准溶液MRM质谱图。

图1 三唑锡、三环锡和苯丁锡MRM色谱图Fig.1 Chromatogram of azocyclotin、cyhexatin and fenbutatin oxide in multiple reactions monitoring mode(MRM)

2.2 衍生化试剂的选择

2.2.1 四乙基硼化钠配制溶液的选择

四乙基硼化钠价格较贵，一般用去离子水或者甲醇配制，但因化学性质不稳定，易遇酸水解和氧化，需要现配现用。卢大胜[15]等研究了四乙基硼化钠的保存条件，发现20%四乙基硼化钠四氢呋喃溶液在3个月内未发现其活性的明显变化，2%四乙基硼化钠四氢呋喃溶液在15 d内未发现其活性的明显变化。本试验将3种有机锡化合物同时采用2%四乙基硼化钠水溶液和2%四乙基硼化钠四氢呋喃溶液进行衍生，结果表明(见图2)，三环锡、三唑锡和苯丁锡经2%四乙基硼化钠水溶液衍生后响应值分别比2%四乙基硼化钠四氢呋喃溶液高20.38%、19.11%和40.44%，为提高实际样品检测分析的灵敏度，选择去离子水作为配制四乙基硼化钠衍生化试剂的溶剂。考虑到四乙基硼化钠水溶液的稳定性，建议根据试验样品的数量，配制适量的溶液，现配现用，可以有效降低试验成本，并显著提高苯丁锡检测分析的灵敏度。

图2 四乙基硼化钠溶剂对衍生化效率的影响Fig.2 Effect of sodium tetraethylborate solvents on derivatization efficiency

2.2.2 两种衍生化试剂添加量考察

在具塞玻璃离心管中分别加入5.0 mg/L的三唑锡、三环锡和苯丁锡3种标准储备液1.0 mL(以Sn计则浓度分别为1.54、1.36、0.564 mg/L)，分别添加2种衍生化试剂0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，在常温条件下，氮气流缓缓吹干有机溶剂，按照1.4.2中2种衍生化方法进行衍生，并将最终体积定容为2.0 mL上机分析。结果表明(见图3)，随着乙基溴化镁乙醚溶液添加量的增加，3种有机锡化合物衍生化产物响应逐渐提高，当含量增加到1.0 mL时，衍生化产物含量呈稳定趋势。为保证衍生化反应完全，选择乙基溴化镁乙醚溶液的添加体积为1.5 mL。随着四乙基硼化钠添加量的增加，三环锡衍生化产物响应逐步提高，在添加量为1.0 mL时最高，三唑锡和苯丁锡在添加量为0.6 mL时最高，之后随着添加量的增加，衍生化产物响应略有降低。综合考虑试验成本及衍生化产物的响应，选择四乙基硼化钠的添加量为0.5 mL。

图3 两种衍生化试剂添加量对衍生化效率的影响比较Fig.3 Comparison of the effects of the additives of two kinds of derivatization reagents on the derivatization

确定衍生化试剂添加量后，比较2种衍生化试剂在最佳添加量下对相同浓度的3种有机锡化合物的衍生化效率。结果表明，三唑锡、三环锡衍生化产物响应接近，而苯丁锡经四乙基硼化钠水溶液衍生后的响应是乙基溴化镁乙醚溶液的1.69倍左右。试验过程中还发现，乙基溴化镁乙醚溶液在衍生3种有机锡化合物的过程中，若3种化合物处在二氯甲烷或丙酮溶剂环境中，将导致衍生化产物的响应近乎一个数量级的降低，而四乙基硼化钠衍生化试剂在衍生过程中则无此现象，在有无溶剂的环境下，衍生条件温和，衍生化产物响应差异不明显。可能由于乙基溴化镁乙醚溶液在进行衍生反应时，需要在严格的无水与不带活泼氢离子的非极性溶剂中进行，同时乙基溴化镁乙醚溶液在冰水浴中逐滴加入时会释放大量热，也不可避免的造成苯丁锡衍生物三(2-甲基-2-苯基丙基)乙基锡的损失，从而导致衍生化效率的降低。而四乙基硼化钠是在水介质和缓冲溶液中均可使用的高效化的衍生化试剂，对衍生条件要求较低且稳定，可同时对3种有机锡化合物进行衍生反应，用途较乙基溴化镁广泛。

2.3 提取条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

有机锡化合物多为固体或油状液体，不溶或难溶于水，易溶于有机溶剂。常用的提取溶剂有正己烷、戊烷、乙腈、二氯甲烷、甲苯等。本试验考察了正己烷、二氯甲烷和乙腈3种提取溶剂对三环锡、三唑锡和苯丁锡提取效果的影响。试验表明，使用正己烷和二氯甲烷提取3种有机锡化合物的回收率在79.4%～85.2%，采用乙腈提取3种有机锡化合物的回收率在50.2%～64.3%。考虑到二氯甲烷毒性较正己烷要大，且二氯甲烷提取基质中的色素较多，不利于下一步净化过程，综合考虑，选择正己烷作为提取溶剂。

2.3.2 提取环境pH值的考察

3种有机锡化合物在不同酸性条件下的提取效率差别较大，KUMAR[20]等发现了一种较广泛的提取方法是将样品酸化后，用甲苯提取有机锡，方法回收率可达到90%。本试验以正己烷为提取溶剂，2%四乙基硼化钠水溶液为衍生化试剂，比较了不同pH条件下的提取效率。称取5.0 g大白菜样品，添加5.0 mL去离子水和5.0 mg/L的三唑锡、三环锡和苯丁锡3种标准储备液1.0 mL，通过向样品中添加盐酸水溶液(体积比为1∶1)，调节样品溶液pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，通过提取和衍生，比较不同pH条件下的提取效率。结果表明(见图4)，3种有机锡化合物受不同pH萃取溶液环境影响较大，随着pH的增大，提取效率逐渐降低。三环锡在pH为4.0的萃取溶液环境中提取效果最好，三唑锡和苯丁锡在pH为3.0的萃取溶液环境中提取效果最好。综合考虑，选择pH为4.0的萃取溶液环境。

图4 pH值对萃取效果的影响Fig.4 Effect of the pH value on extraction efficiency

2.4 基质效应的考察

基质效应(ME)指样品中除分析物以外的其它成分对待测物测定值的影响，即基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。

(1)

式中：Pm为基质加标峰面积；Ps为纯溶剂标准溶液峰面积。

本试验前处理过程用到大量有机试剂、酸和衍生化试剂，可能对目标物的响应产生一定的影响，按照STAHNKE[21]中的添加法定量评价基质效应强度，分别测定空白提取液与纯溶剂中添加相同浓度分析物的离子响应强度，考察了在添加1.00 mg/kg(以Sn计)条件下，不同基质条件对3种有机锡化合物响应的影响，结果见图5。

图5 不同基质对三唑锡、三环锡和苯丁锡的基质效应影响(n=3)Fig.5 Effect of different matrices on matrix effects of azocyclotin、cyhexatin and fenbutatin oxide (n=3)

苯丁锡在白菜和茄子样品中存在微弱的基质抑制效应，3种有机锡化合物在其它基质中均存在基质增强效应，这与已知的气相色谱分析中大多数农药表现出不同程度的基质增强效应论点相吻合。不同基质中，三唑锡的基质增强效应比三环锡和苯丁锡强，而一般热极性、不稳定、具有氢键结果能力的农药在气相色谱残留分析中较易产生基质效应，可能与三唑锡含有的胺基基团在酸性条件下不稳定，易分解有关。3种有机锡化合物在香蕉中的基质增强效应均比其它基质要强，可能与香蕉基质中含有较多的糖分、蛋白质等成分有关，在前处理过程中未得到有效的净化。在基质效应存在的情况下，本试验选取基质匹配标准曲线定量，可以一定程度上降低基质效应的影响，使定量结果更加准确。

2.5 方法的线性范围、加标回收率、精密度和定量限

取0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L 6个质量浓度的三唑锡、三环锡和苯丁锡化合物，按优化色谱条件进样1 μL，以峰面积为纵坐标，标准样品的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，其线性回归方程及相关系数见表2，以信噪比S/N≥3估算仪器的检出限(LOD)，S/N≥10估算仪器的定量限(LOQ)，结果如下(见表2)。

表2 三唑锡、三环锡和苯丁锡化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

称取市售的大白菜、茄子、土豆、柑桔、苹果5个样品，分别添加0.010 0、0.020 0和0.050 0 mg/kg不同水平的3种有机锡化合物标准溶液进行回收率试验，每个添加水平重复3次，加标回收结果(见表3)。3种有机锡化合物的平均回收率为76.2%～92.0%，相对标准偏差小于8.5%，符合GB/T 27404—2008附录F中对检测方法确认的要求。

表3 三唑锡、三环锡和苯丁锡化合物的加标回收率及相对标准偏差(n=3)

续表3

衍生化试剂检测基质加标水平/(mg·kg-1)三唑锡三环锡苯丁锡回收率/%相对标准偏差RSD/%回收率/%相对标准偏差RSD/%回收率/%相对标准偏差RSD/%乙基溴化镁四乙基硼化钠乙基溴化镁四乙基硼化钠乙基溴化镁四乙基硼化钠柑桔0.0174.22.379.32.588.65.278.23.180.33.577.82.60.0283.35.583.51.878.03.388.81.185.32.377.42.50.0592.03.388.52.386.12.689.92.576.83.485.15.5乙基溴化镁四乙基硼化钠乙基溴化镁四乙基硼化钠乙基溴化镁四乙基硼化钠苹果0.0177.54.777.76.680.36.680.26.379.35.881.25.30.0279.55.285.23.585.62.884.03.486.33.884.31.90.0577.82.289.62.189.51.585.64.790.51.990.51.2

2 结论

本试验比较了乙基溴化镁乙醚溶液、四乙基硼化钠2种衍生化试剂用于3种有机锡化合物衍生化反应的优劣，2种衍生化试剂均可用于三唑锡、三环锡的衍生化反应检测。苯丁锡采用2%四乙基硼化钠水溶液衍生后产物响应较高，且该试剂在水介质和缓冲溶液中均可使用，对衍生条件要求较低且稳定，用途比乙基溴化镁乙醚溶液更为广泛。并对3种有机锡化合物在不同基质中的基质效应进行了探讨，采用基质匹配标准曲线定量可以有效降低基质效应。采用优化后的GC-MS/MS方法，在空白样品添加浓度为0.01、0.02、0.05 mg/kg的范围内，3种有机锡化合物的平均回收率范围为76.2%～92.0%，相对标准偏差小于8.5%，符合GB/T 27404—2008附录F中对检测方法确认的要求。因此优化后的该方法检出限低、灵敏度高，适用于水果、蔬菜中有机锡化合物的定量检测。

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