响应面优化的南极磷虾蛋白磷酸化改性工艺

戚亭，陈雪忠，刘志东*，刘宝林，黄洪亮，曲映红，汪雯翰

1(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海,200093) 2(中国水产科学研究院东海水产研究所，上海,200090) 3(上海海洋大学食品学院，上海,201306) 4(上海市农业科学院食用菌研究所，上海,201403)

天然来源蛋白质由于结构等因素，其某些功能特性在应用方面受到很大的限制。为了更广泛地被应用，需对食品蛋白质的功能特性进行改性。常用的食品蛋白质改性方法包括：物理改性、化学改性和生物改性，即借助外界因素促使蛋白质的氨基酸残基，蛋白质分子重排，空间结构和理化性质改变，进而影响功能特性[1]。蛋白质的磷酸化改性是蛋白质支链上的羟基被磷酸根取代的过程，被认为是一种有效改善蛋白质功能特性的化学改性方法[2]。近年来，以花生蛋白、乳蛋白、鸡蛋清蛋白、大豆分离蛋白等为原料开展的磷酸化改性研究表明改性蛋白结构发生变化，蛋白质功能特性得到明显改善，且磷酸化对蛋白质的消化影响不显著[3-7]。然而，针对南极磷虾蛋白的磷酸化改性的研究至今鲜有报道。

南极磷虾(EuphausiasuperbaDana)是一种生活在南冰洋的南极洲水域的磷虾，生物资源量巨大[8-10]。南极磷虾蛋白中含有FAO/WHO要求的人体必需的全部的氨基酸[11-12]。南极磷虾蛋白的生物价极高，但是由于受功能特性所限，其应用领域较窄；若能够经过改性改善南极磷虾蛋白质的功能和营养特性，可进一步拓宽南极磷虾蛋白质的综合利用[13-14]。

本文以南极磷虾蛋白为原料进行磷酸化改性研究，通过优化南极磷虾蛋白磷酸化改性条件，以期能够为南极磷虾蛋白资源的开发利用等提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极大磷虾(EuphausiasuperbaDana) 2016年由上海开创远洋渔业有限公司于南极设得兰群岛海域捕获，储存于实验室超低温冰箱中备用。

HCl、三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate,STP)、NaOH、醋酸锌、NaH2PO4、氨水-氯化铵缓冲液(pH=10)、EDTA-二钠、Na2PO4、铬黑T、三氯乙酸(trichloroaceticacid,TCA)等，试剂均为国产级分析纯。

1.2 仪器和设备

TGl-16M高速台式冷冻离心机；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；电子天平；PHS-3C型pH计； PRO250均质器；傅里叶红外光谱测试仪；UV-2102PCS型紫外可见分光光度计；BM255搅拌机；真空冷冻干燥机。

1.3 试验方法

1.3.1 南极磷虾蛋白的提取

参照高飞等的方法[15-16]。

1.3.2 脱脂南极磷虾蛋白的制备

参照WANG[17-18]等的方法但略有改动，室温下采用95%的乙醇对南极磷虾蛋白粉脱脂处理，磁力搅拌每间隔2～3 h更换1次乙醇至脂肪去除，结束后于通风橱中风干。

1.3.3 脱脂南极磷虾蛋白三聚磷酸钠的磷酸化[19]

(1)取磷酸盐缓冲液(pH=7.4)溶解脱脂南极磷虾蛋白，10 000 r/min均质后室温搅拌1 h。

(2)加入三聚磷酸钠，调节反应pH，于恒温加热磁力搅拌器中反应。

(3)反应结束后，将反应后的磷酸化蛋白置于4 ℃环境多次透析除盐。

(4)将透析好的样品冷冻干燥，-80 ℃储存备用。

1.3.4 磷酸化程度测定[20-21]

参考孟陆丽等的方法但略有改动。取透析后的脱脂南极磷虾蛋白磷酸化反应液5 mL，加入10% TCA沉淀蛋白质，10 000 r/min离心10 min，向上清液中加入过量1 mol/L的醋酸锌，使其中的焦磷酸在pH 3.8～3.9条件下以焦磷酸锌的形式沉淀，然后用pH 10的氨水-氯化铵缓冲液溶解焦磷酸锌，用2～3滴铬黑T做指示剂，用0.02 mol/L的EDTA-Na2标准溶液滴定，当溶液的颜色由紫红变成蓝色时即为滴定终点，按公式(1)计算:

磷酸化程度/(mg·g-1)=C×(V2-V1)×Mp/2m

(1)

式中：C为EDTA-Na2标准溶液的浓度，mol/L；V1为滴定空白所耗EDTA-Na2标准溶液的体积，mL；V2为滴定样品所耗EDTA-Na2标准溶液的体积，mL；MP为磷的相对原子质量为30.97；m为样品中南极磷虾蛋白的质量，g。

1.3.5 脱脂南极磷虾蛋白的磷酸化反应条件优化

1.3.5.1 单因素实验

以脱脂南极磷虾蛋白为原料，分别考察蛋白质质量浓度(10～50 g/L)、pH值(7～11)、三聚磷酸钠添加量为1～8 g/100g蛋白、反应时间(1～3 h)、反应温度(25～45 ℃)对南极磷虾蛋白磷酸化水平的影响，实验因子均设置5个梯度水平，且均做3次平行。

1.3.5.2 响应面实验

选用最优的单因素实验条件，以磷酸化水平为响应值，进行5因素3水平的响应面优化实验。

1.3.6 数据统计与分析

利用Excel 2013、Origin 8.0分析整理单因素实验结果，以“平均值±标准差”表示；OMNIC 8.0等软件对傅里叶红外光谱数据整理作图；Design Expert 7.1.3进行响应面实验设计、SPSS 18.0分析处理组间显著性差异。

1.3.7 脱脂南极磷虾蛋白磷酸化的红外光谱[22]

样品经KBr粉末混合压片处理后静置测定。扫描波数为400～4 000 cm-1，扫描数为64。

2 结果与讨论

2.1 磷酸化改性的单因素实验

2.1.1 蛋白质质量浓度对磷酸化水平的影响

配制质量浓度为10～50 g/L的脱脂南极磷虾蛋白溶液，加入一定量的三聚磷酸钠，在30 ℃下反应2.5 h，测定改性后蛋白磷酸化程度，反应的pH为8.5。蛋白质质量浓度对磷酸化程度的影响如图1所示。

图1 蛋白质浓度对磷酸化程度的影响Fig.1 The effect of concentration of protein on the degrees of phosphorylation

从图1可以看出，磷酸化程度随底物南极磷虾蛋白含量的增加而增加，达到最大磷酸化程度后，随底物浓度的增大而缓慢降低，这是因为蛋白质浓度低时，STP与蛋白质之间比例极低，STP未能全部与蛋白质氨基酸残基发生反应，随着蛋白质浓度的增加，蛋白质与STP逐渐达到最适比例，与三聚磷酸钠反应的蛋白质达到饱和状态，此时的南极磷虾蛋白质的磷酸化程度最高，所以实验选取蛋白质质量浓度为20 g/L为最优改性蛋白浓度。

2.1.2 反应时间对磷酸化程度的影响

配制质量浓度为20 g/L的脱脂南极磷虾蛋白溶液，加入三聚磷酸钠量为4%、反应时间分别设置为1、1.5、2、2.5、3 h、pH为8.5、反应温度30 ℃，测定改性后蛋白磷酸化程度，其变化结果如图2所示。

图2 反应时间对磷酸化程度的影响Fig.2 The effect of time on the degrees of phosphorylation

从图2可以看出，磷酸化程度随反应时间的变化规律是先增加后慢速降低，即表示一定条件下，南极磷虾蛋白质磷酸化改性可以在短时间内快速完成，在反应时间为1.5 h磷酸化程度达到最佳值，后南极磷虾蛋白质磷酸化程度缓慢下降，表明可能反应已基本完全[23]，时间的延长也可能导致蛋白质的部分降解，使得南极磷虾蛋白质的磷酸化程度降低。

2.1.3 STP添加量对磷酸化程度的影响

配制2%的脱脂南极磷虾蛋白溶液，分别加入1、2、4、6、8 g/100g蛋白的三聚磷酸钠，调节pH为8.5、30 ℃下反应1.5 h，测定改性后蛋白质磷酸化程度，其变化结果如图3所示。

图3 STP添加量对磷酸化程度的影响Fig.3 The effect of concentration of STP on the degrees of phosphorylation

图3表明蛋白质的磷酸化程度随三聚磷酸钠的添加量增加呈现先增后减的趋势，STP添加量为1～6 g/100g蛋白时，南极磷虾蛋白质的磷酸化程度增加显著，继续增加STP的添加量到6～8 g/100g，蛋白质磷酸化程度明显下降，说明一定范围内增加STP的添加量有利其与蛋白质的充分反应，但过量的三聚磷酸钠，引入的磷酸根基团数量增加，蛋白质分子间静电斥力增大，参加磷酸化反应的有效蛋白质分子减少，磷酸化程度下降，所以后续实验选择6 g/100g蛋白的STP添加量，计算磷酸化程度为30.97 mg/g蛋白。

2.1.4 pH对磷酸化程度的影响

将脱脂南极磷虾蛋白不同pH(7～11)条件下反应，其磷酸化程度变化结果如图4所示。随着pH的增加南极磷虾蛋白质磷酸化程度先增加后减少，在pH值为9附近达到最大。根据磷酸化改性的原理，氨基与三聚磷酸钠的反应在碱性条件下更易发生，蛋白质的磷酸化程度也相应较高[24]，但是随着pH的继续上升，南极磷虾蛋白的磷酸化程度降低，可能是因为过强的碱性条件导致蛋白质变性，使得与氨基结合的蛋白质数量降低，降低了南极磷虾蛋白的磷酸化水平[25]。

图4 反应pH对磷酸化程度的影响Fig.4 The effect of pH on the degrees of phosphorylation

2.1.5 反应温度对磷酸化程度的影响

将脱脂南极磷虾蛋白在25～45 ℃温度下反应，磷酸化程度随温度变化结果如图5所示。磷酸化程度随反应温度升高至40 ℃时达到最大，后缓慢降低。温度升高，分子活化能上升使得蛋白质磷酸化程度更加有效率[26]，但是过高的反应温度反而使蛋白质变性机率增加，与STP反映的蛋白质数量下降，磷酸化程度下降。

图5 反应温度对磷酸化程度的影响Fig.5 The effect of temperature on the degrees of phosphorylation

2.2 响应面优化分析

以三聚磷酸钠添加量、反应pH、蛋白质浓度等为自变量，磷酸化程度为因变量，采用Box-Benhnken试验设计5因素3水平的响应面实验(见表1)。

表1 响应面设计因子水平表

2.2.1 回归方程的建立

表2即响应面试验设计；采用Design-Expert 7.1.3软件处理，响应面方差分析结果见表3。

表2 磷酸化蛋白响应面分析设计及结果

对表2的数据分析得到南极磷虾蛋白磷酸化程度(响应值y)对5个单因素的二次多项回归曲线，剔除不显著项AC、AD、CD、CE、DE后对方程进行优化得方程：

y=41.29+3.48×A+1.26×B+1.45×C+1.65×D-0.48×E+2.33×A×B-2.33×A×E+1.94×B×C-3.49×B×D+1.93×B×E-10.71×A2-3.10×B2-9.81×C2-9.55×D2-4.65×E2

(1)

注：p<0.05表示差异显著，以*表示；p<0.01表示差异非常显著，以**表示；p<0.001表示差异极显著，以***表示。

表3中F值表示的是单因素对南极磷虾蛋白磷酸化程度的影响程度，F值越大，说明影响就越大[27]。由5个影响因素的F值大小可以推断出5因素对影响排序为A>D>C>B>E，其中因素A(蛋白质浓度)对南极磷虾蛋白磷酸化程度高度显著，B(三聚磷酸钠添加量)、C(反应时间)、D(反应pH值)、BD对南极磷虾蛋白磷酸化程度影响极显著(p<0.01)，AB、AE、BC、BD、BE对南极磷虾蛋白磷酸化程度影响较显著(p<0.05)，E(反应温度)、AC、AD、CD、CE、DE的p>0.05，表明其对南极磷虾蛋白磷酸化程度没有显著影响，A2、B2、C2、D2、E2对南极磷虾蛋白磷酸化程度的影响高度显著。

采用Design-Expert 7.1.3 软件根据多元回归拟合分析处理5个因素对南极磷虾蛋白磷酸化水平影响的结果见图6。由图6看出，蛋白质浓度和三聚磷酸钠添加量(AB)、蛋白质浓度和反应温度(AE)、三聚磷酸钠添加量和反应时间(BC)、三聚磷酸钠添加量和反应pH值(BD)、三聚磷酸钠添加量和反应温度(BE)对南极磷虾蛋白的磷酸化水平影响显著[29]。

图6 各两因素交互作用对南极磷虾蛋白磷酸化程度影响的响应面图Fig.6 Response surface plots and contour plots indicating the interactive between two factors on the phosphorylation of Antarctic krill protein

2.2.2 模型的优化和验证

通过单因素和响应面优化实验得到最佳的南极磷虾蛋白磷酸化改性的条件为蛋白质浓度22 g/L、三聚磷酸钠添加量6.55 g/100g蛋白、反应时间1.55 h、反应pH值9.04、反应温度39.90 ℃，在该条件下磷酸化水平约为41.91 mg/g。取最优的单因素条件进行三次磷酸化改性验证实验，在该条件下磷酸化水平约达40.78 mg/g，与预测值误差为2.7%，说明该模型可以较好地预测磷酸化改性条件与磷酸化水平之间的相关关系。

2.3 磷酸化南极磷虾蛋白的红外光谱分析

通过南极磷虾蛋白磷酸化后的红外光谱图分析，磷酸化南极磷虾蛋白在1 500～1 700 cm-1存在以波数1 533 cm-1、1 646 cm-1为峰值的红外吸收峰；在1 000～1 300 cm-1存在以波数1 076 cm-1和1 237 cm-1为峰值的红外吸收峰。

图7 南极磷虾磷酸化蛋白的红外光谱图Fig.7 The infrared spectra of phosphorylated protein in Antarctic krill

据文献报道，1 000～1 300 cm-1的峰值由羟基氨基酸残基的C—O伸缩振动和C—O—H弯曲振动产生，—OH磷酸化增强了振动时的偶极矩和振动强度，说明1 076 cm-1和1 237 cm-1处的吸收峰为C—O—P 产生的伸缩振动，即蛋白质氨基上的氢被磷酸根基团取代的过程。这与王彦超研究的南极磷虾蛋白磷酸化后在1 000～1 300 cm-1存在以波数1 083 cm-1和1 241 cm-1为峰值的红外吸收峰结果基本相同，表明南极磷虾蛋白磷酸化改性是切实可行的。磷酸化水平的高低可以通过峰值强弱得知[30-32]。

3 结论

本实验建立了以蛋白质磷酸化程度为响应值，以蛋白质浓度、STP添加量、反应pH值等因素为因子的数学模型，优化确定的南极磷虾蛋白质磷酸化条件为蛋白质质量浓度22 g/L、三聚磷酸钠添加量6.55 g/100g蛋白、反应时间1.55 h、反应pH值9.04、反应温度39.90 ℃，在该条件下磷酸化水平为41.91 mg/g。结合实际实验调整进行3次验证实验，测得南极磷虾蛋白磷酸化改性水平为40.78 mg/g，这与预测值误差为2.7%，且傅里叶红外光谱实验也证明利用三聚磷酸钠对南极磷虾蛋白进行磷酸化改性是实际可行的，真实值与预测值之间的差距来源于实验过程可能存在的干扰因素，其他可能因素对蛋白质磷酸化改性水平的影响还需更深层次的探讨。

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