罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的提取及溶解性、氨基酸组成分析

齐慧红，周春霞，朱潘红，李婷，洪鹏志

(广东海洋大学 食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江，524088)

混合蛋白的研究引起国外学者的普遍关注，共沉淀蛋白(co-precipitates protein, CoPP)是指从一种或者多种原料中采用等电点沉淀、酸-热沉淀或酸-热诱导并辅以沉淀剂如CaCl2等方法得到的一种混合蛋白[1]。不同来源的蛋白质制备的共沉淀蛋白，不仅在营养上可以实现氨基酸的互补[2]，而且具有良好的功能特性[3-5]和理想的感官特性[1,6]。大豆粉和花生粉提取的大豆-花生共沉淀蛋白在pH 2.5、5.0、7.0和9.0溶解时，在极端酸性pH 2.5条件下显示溶解性最好，且高于单个大豆分离蛋白和花生分离蛋白的溶解性，大豆-花生共沉淀蛋白的亮度(L*)处于2种分离蛋白之间[7]；大豆-乳清共沉淀蛋白和棉籽-乳清共沉淀蛋白与单个分离蛋白相比，具有较高的溶解性、蛋白得率、蛋白评分及亮度(L*)[8]；在鸡肉丸中添加不同配比7 S/11 S大豆球蛋白，可以显著改善鸡肉丸色泽、硬度和弹性等品质[9]。此外，动植物蛋白直接混合制备的共沉淀蛋白，其产品品质也有一定的改善效果，如将大豆分离蛋白添加于牛乳中，研制新型双蛋白酸奶，研究发现，产品营养互补均衡[10]。本研究结合罗非鱼蛋白的营养优势[11]和大豆蛋白的功能特性优势[12]，以罗非鱼肉和脱脂豆粕为原料，用pH调节法提取罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白，开发新型“双蛋白”产品，并对其性质进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低温脱脂豆粕，购于湖北荆州三菱湖小渔村(2017.2)，采用全自动凯氏定氮法(N×6.25)测得粗蛋白含量为(43.75±0.06)%，在实验室经万能粉碎机粉碎后过100目筛备用；罗非鱼(Oreochromisniloticus)，购于湛江水产市场(2017.2—2017.5)，鲜活迅速运回实验室，取背部白肉，绞碎后分装(500 g/袋)，于-20 ℃冷冻备用，采用全自动凯氏定氮法(N×6.25)测定粗蛋白含量(15.76±0.23)%。

Folin-酚蛋白定量试剂盒,购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

PHSJ-4A型数显pH计,上海雷磁仪器厂；EMS-4B磁力搅拌器,天津市欧诺仪器仪表有限公司；Avanti J-26sxp高效离心机,美国Beckman公司；VAP-450凯氏定氮消化炉和凯氏定氮蒸馏器,德国Gerhardf公司；EVO 300 PC紫外-可见分光光度计,美国Thermo Fisher Scientific公司；FDU-1100真空冷冻干燥机,日本托普仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的提取[13]

罗非鱼鱼肉(使用之前取样，室温解冻)和脱脂豆粕粉分别按1∶1、1∶2和2∶1的质量比混合(以干基计)，以不添加脱脂豆粕粉(1∶0)和不添加罗非鱼肉(0∶1)为对照组→加冰蒸馏水[料水比=1∶9(g∶mL)]→均质2 min→调pH值2～12(变化区间为0.5或者1个pH单位)，离心后收集上清液即为可溶性鱼肉蛋白、大豆蛋白和共沉淀蛋白，采用全自动凯氏定氮法(N×6.25)测定样品中粗蛋白含量，计算公式如下：

(1)

1.2.2 罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的制备[13]

由1.2.1得到的上清液→调pH(可溶性鱼肉蛋白等电点5.5，可溶性大豆和共沉淀蛋白等电点4.5)→离心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)→沉淀→加少量冰水分散，调pH 7.0→真空冷冻干燥→蛋白粉→真空包装-20 ℃保存。

1.2.3 基本成分的测定

原料比按1∶0、1∶1、1∶2、2∶1和0∶1制备的蛋白粉分别记为罗非鱼分离蛋白(FPI)、共沉淀蛋白(CoPP-1∶1、CoPP-1∶2、CoPP-2∶1)和大豆分离蛋白(SPI)。水分、灰分、粗脂肪的测定按GB5009—85进行，粗蛋白的测定采用全自动凯氏定氮法(N×6.25)。

1.2.4 罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白溶解度的计算

蛋白粉加一定量的冰蒸馏水，配制成浓度为5 g/L的蛋白溶液，用1 mol/L的NaOH或HCl溶液调节到相应的pH值，在4 ℃下磁力搅拌30 min，离心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)，上清液中蛋白的含量用Folin-酚试剂盒定量测定[13]。

(2)

1.2.5 罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白度的测定

共沉淀蛋白的白度(whiteness)采用色差计，用L*值，a*值，b*值表示，每个样品重复测定3次，取平均值[14]。按下式计算白度：

(3)

1.2.6 氨基酸组成分析

用6 mol/L HCl处理样品，然后采用835-50日本日立型氨基酸分析仪测定水解氨基酸，再用4 mol/L LiOH处理样品，采用同机测定色氨酸。氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)的计算参考1985年FAO/WHO推荐的营养品质评价方法[15]：

(4)

(5)

1.2.7 统计分析

采用SPSS 13.0软件，以p<0.05为差异进行显著性分析。

2 结果分析

2.1 罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白提取条件的确定

不同pH值和原料比对可溶性蛋白溶解性的影响，如图1所示。

图1 pH值和原料比对可溶性蛋白溶解得率的影响Fig.1 Effect of pH value and raw material ratio on the solubility of soluble protein

在实验范围内，可溶性鱼蛋白、大豆蛋白和混合体系的可溶性共沉淀蛋白的溶解性随pH值的变化趋势基本一致，溶解曲线均呈现U型，类似于罗非鱼[16]、大豆[17]的溶解曲线。原料比以1∶1、1∶2和2∶1提取的可溶性共沉淀蛋白和大豆蛋白均在pH 4.5时，蛋白的溶解得率最低，分别为13.79%、10.18%、15.17%和3.88%，沉淀得率最高(数据未列出)，而可溶性鱼肉蛋白在pH 5.5时蛋白的溶解得率(16.99%)最低，沉淀得率最高(数据未列出)，主要是在等电点pH值范围内，蛋白质分子表面净电荷几乎为零，分子间的静电斥力消失，水合作用最弱，分子容易聚集沉淀，溶解度降低[18]。偏离等电点的酸性和碱性pH范围内，可溶性蛋白得率呈现上升趋势，且在极端酸碱pH 2.0、3.0、11.0、12.0达到最大值。这是因为酸性条件下，由于天门冬氨酸和谷氨酸的残基的支链羧基所带的负电荷被中和，所以蛋白分子带有净正电荷；碱性条件下，部分氨基酸的碱性集团，如精氨酸和赖氨酸的支链胍基或者氨基等发生了去质子化反应，导致蛋白分子带有净负电荷，蛋白与水分子作用增加，蛋白溶解性也增大[19]。另外，在其他条件相同时，不同质量比混合的原料得到的可溶性蛋白的溶解得率也不完全相同，在酸性范围内，如极端pH 2.0和3.0时，可溶性鱼肉蛋白的溶解得率最高，在73%左右，其次是罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以质量比(干基计)2∶1、1∶1和1∶2提取的可溶性共沉淀蛋白，但其溶解得率均低于70%。说明2∶1提取的可溶性共沉淀蛋白是鱼肉蛋白占主要部分，故溶解得率接近于可溶性鱼肉蛋白，而1∶2提取可溶性共沉淀蛋白是大豆蛋白占主要部分，故其溶解得率相比于其余2种共沉淀蛋白较低，1∶1提取的可溶性共沉淀蛋白的溶解得率处于中间，初步说明共沉淀蛋白组成既包含鱼肉蛋白也有大豆蛋白。在极端pH 11.0和12.0时，2∶1制备的可溶性共沉淀蛋白的溶解得率高于70%，可溶性鱼肉蛋白与1∶1、1∶2制备的可溶性共沉淀蛋白溶解得率差异不大，均在67%左右，可能是在酸性范围内，鱼肉蛋白的水合作用占主导地位，在碱性范围内，则是大豆蛋白的水合作用占优势，以及鱼肉蛋白与大豆蛋白的相互作用；由此设定提取共沉淀蛋白的、大豆蛋白和鱼肉蛋白的最适酸溶pH为2.0和3.0，碱溶pH为11.0和12.0，等电点分别为pH 4.5、4.5和5.5。

2.2 罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白基本成分分析

可溶性鱼肉蛋白(等电点5.5)、大豆蛋白和共沉淀蛋白(等电点4.5)在pH 2.0、3.0、11.0、12.0条件下溶解，再各自等电点沉淀，冷冻干燥制备罗非鱼分离蛋白(FPI)、共沉淀蛋白(CoPP-1∶1、CoPP-1∶2、CoPP-2∶1)和大豆分离蛋白(SPI)等18种蛋白粉，分析其基本成分，见表1。

表1 罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白粉的基本成分 单位：%

注:不同的字母表示同一列差异显著(p<0.05)。

由表1可知，不同pH溶解和不同pH沉淀制备的共沉淀蛋白的粗蛋白的含量均高于80%，与FPI和SPI粗蛋白含量相比，在pH 12.0条件下提取的CoPP-2∶1粗蛋白含量最高(89.55%)，其次是在pH 2.0条件下提取的CoPP-1∶1，为88.05%，主要是在极端酸碱条件下可回收大部分的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白，只有少量的结缔组织蛋白和膜结构蛋白没有被回收利用[20]，故蛋白回收率较高。而在pH 3.0条件下提取的CoPP-1∶2的粗蛋白含量最低(80.42%)，可能是大豆蛋白在酸性范围内溶解性较差。表中FPI、SPI和共沉淀蛋白的粗脂肪含量均低于1.07%，且碱溶酸沉蛋白的脂肪含量低于酸溶酸沉蛋白，可能与实验的方法及纱布过滤的操作有关。FPI的灰分含量相比于SPI较低，共沉淀蛋白灰分含量高于FPI而低于SPI，这一结果与张梦霞[13]的研究结果相似，且CoPP-1∶1比CoPP-1∶2和CoPP-2∶1的灰分含量低，表明原料按1∶1制备的共沉淀蛋白能更有效去除原料中Ca、Na等盐类及其他不溶性物质，可能是CoPP-1∶1中添加的豆粕粉含量低于CoPP-1∶2，造成大豆蛋白的含量相对较低，而CoPP-2∶1中鱼肉蛋白占主要成分，使灰分含量也较高。总之，罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的粗蛋白含量较高，适于做蛋白功能性质的研究。

2.3 pH值对罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白溶解性的影响

图2显示FPI、CoPP-1∶1、CoPP-1∶2、CoPP-2∶1、SPI等18种蛋白粉在广泛pH值条件下的溶解性。由图2可知，pH值和原料比对蛋白的溶解性的影响比较明显，在pH 4.0～6.0附近，蛋白的溶解度较低，当pH偏离该区域时溶解度迅速增加，在极端酸碱条件下，蛋白的溶解度达到最大，有的几乎完全溶解，与大豆粉和花生粉提取的大豆-花生共沉淀蛋白的结果类似[7]，原理就是利用蛋白随pH变化明显的特点，在等电点附近，由于分子间静电斥力的减小，蛋白迅速聚集沉淀，导致溶解度下降，达到最低，而偏离等电时，由于pH的作用蛋白带上同种电荷，带电的蛋白与水分子之间通过离子-偶极相互作用增强，从而增加了蛋白的溶解度[18-19]。从蛋白组成分析看，SPI的主要成分是水溶性球蛋白，在碱性范围内溶解性最好，主要是在此条件下蛋白分子展开度增加，水合作用增强，因此溶解度较高；CoPP-1∶2在碱性范围内的溶解度也较高，可能是原料比1∶2制备的共沉淀蛋白中大豆蛋白水溶性球蛋白增加，致使溶解度提高。FPI和CoPP-2∶1的溶解度在pH 7.0～8.0范围内低于CoPP-1∶1、CoPP-1∶2和SPI，可能是FPI的主要成分是盐溶性蛋白，在碱性范围内，溶液中游离的电荷增多到一定程度，SPI所带电荷被中和，双层电荷遭到破坏，SPI分子从溶液中析出，造成共沉淀蛋白主要成分是鱼肉蛋白的溶解度降低。不同的蛋白在相同pH值下的溶解度差别不大，但是碱提蛋白的溶解性较好，可能与酸溶过程中蛋白变性有关。总体而言，CoPP-1∶1和CoPP-1∶2在中性范围内可以改善其在水中的溶解性。

(a)、(b)、(c)、(d)、(e)分别表示FPI、CoPP-1∶1、CoPP-1∶2、CoPP-2∶1、SPI的溶解度图2 pH值对共沉淀蛋白溶解性的影响Fig.2 Effect of pH on solubility of co-precipitates protein

2.4 罗非鱼-豆粕共蛋白的色差分析

不同溶解-沉淀pH值条件下提取的蛋白粉，对其进行白度的测定，结果如表2所示。pH调节法回收了绝大部分蛋白，色素成分也可能随着蛋白的提取而被提取出来，故SPI偏黄，另外，鱼肉中的血红蛋白在极端pH条件下发生氧化[21]，因此b*值较高可能是血红蛋白和肌红蛋白发生变性和氧化造成的结果[22]，而且样品中脂肪氧化也会导致蛋白颜色变黄。SPI的白度最低，均低于63.20，添加鱼肉后制备的CoPP-1∶1和CoPP-1∶2白度有所提高，且CoPP-2∶1的白度显著提高，大约在72左右；比较而言，共沉淀蛋白的白度高于或者接近FPI白度，可能是共沉淀蛋白中鱼肉蛋白(肌原纤维蛋白、肌浆蛋白、肌浆蛋白等成分)增加。总的分析结果说明共沉淀蛋白的白度优于或者接近FPI和SPI，与大豆-乳清共沉淀蛋白和棉籽-乳清共沉淀蛋白的亮度高于单个分离蛋白的结果相似[8]。

2.5 罗非鱼-豆粕共蛋白氨基酸组成分析和必需氨基酸评价

选取酸溶-酸沉(pH 2.0～4.5)/碱溶-酸沉(pH 11.0～4.5)制备的蛋白粉。表3列出了不同蛋白粉中常见的17种氨基酸组成，包含9种必需氨基酸(组氨酸为婴儿必需氨基酸)，说明蛋白中氨基酸种类齐全，含有成人和婴儿所需的必需氨基酸。参考FAO/WHO推荐的蛋白质理想模式，优质蛋白质中必需氨基酸占总氨基酸的40%左右，必需氨基酸与非必需氨基酸比值在60%以上[15]。SPI中谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、色氨酸含量高于FPI，而FPI中赖氨酸、亮氨酸和丙氨酸等含量高于SPI，赖氨酸是人体第一必需氨基酸，在谷物蛋白中和其他一些植物蛋白中含量较低[23]，因此，鱼蛋白可作为懒氨酸强化剂与植物蛋白复合使用，在营养上可以实现氨基酸的互补[2]。研究结果显示罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白中必需氨基酸占总氨基酸的含量均大于40%，必需氨基酸与非必需氨基酸比值在70%以上，符合FAO/WHO推荐的蛋白质理想模式，具有较好的营养性；与SPI和FPI相比，共沉淀蛋白的蛋氨酸、懒氨酸、甘氨酸和谷氨酸等含量处于两者之间，如共沉淀蛋白的含硫氨基酸(蛋氨酸)含量虽然小于FPI，但与SPI相比，其含硫氨基酸(蛋氨酸)含量有了显著提高，说明共沉淀蛋白可以取长补短，氨基酸平衡效果较好。另外，从原料的组成和pH变化可以看出，必需氨基酸和呈味氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸)含量从高到低依次是FPI>CoPP-1∶1>CoPP-2∶1>CoPP-1∶2>SPI，且碱提蛋白高于酸提蛋白，可能与蛋白的组成及变性程度。总之，共沉淀蛋白在营养上可以实现氨基酸的互补。

表2 不同蛋白粉的白度 单位：%

注：L*表示样品的亮度；a*正值表示偏红，负值表示偏绿；b*正值表示偏黄，负值表示偏蓝。

表3 不同蛋白粉的氨基酸组成及含量 单位：g/100g(蛋白)

注：*表示必需氨基酸，TEAA：必需氨基酸总量，TAA：氨基酸总量，TNEAA：非必需氨基酸总量。

共沉淀蛋白的AAS、CS见表4。按照1985年FAO/WHO推荐的蛋白质模式[15]，对于成人水平，pH调节法提取的蛋白AAS均大于1，满足成年人对氨基酸需求水平。另外，按照婴儿水平模式，FPS、SPI和共沉淀蛋白的第一限制性氨基酸均为组氨酸，AAS为0.45左右；FPI和共沉淀蛋白的第二限制性氨基酸为缬氨酸，AAS为0.68左右，而SPI的第二限制性氨基酸为苏氨酸，AAS为0.60，因此共沉淀蛋白不能单纯作为婴儿食品的蛋白来源，但共沉淀蛋白中赖氨酸的AAS最高，已经达到了标准模式的1.1倍左右。根据CS，除了赖氨酸达到标准，共沉淀蛋白的氨基酸评分普遍比鸡蛋蛋白低，FPI和共沉淀蛋白的第一限制性氨基酸为组氨酸，SPI的第一限制性氨基酸为色氨酸。比较不同蛋白的评分，发现共沉淀蛋白的评分优于或者接近FPI/SPI的评分。

表4 不同蛋白粉的必需氨基酸评价

3 结论

在极端酸碱(pH 2.0、3.0、11.0和12.0)条件下以罗非鱼和脱脂豆粕为原料提取的共沉淀蛋白溶解得率较高；经冷冻干燥制备的共沉淀蛋白，其粗蛋白的含量均高于80%，脂肪含量低于1.07%；pH对共沉淀蛋白溶解度的影响比较明显，均在pH 4.0～6.0溶解性较差，而pH值低于4.0或高于6.0时，溶解度提高，且在极端酸碱pH范围内溶解度达到最大；共沉淀蛋白的白度较好，必需氨基酸种类齐全，且占总氨基酸的含量均大于40%，与SPI和FPI相比，共沉淀蛋白的蛋氨酸、懒氨酸、甘氨酸和谷氨酸等含量处于两者之间，可见共沉淀蛋白实现了氨基酸互补；pH调节法提取的共沉淀蛋白AAS均大于1，满足成年人对氨基酸需求水平，按照婴儿水平模式，共沉淀蛋白的第一限制性氨基酸为组氨酸，其CS优于或者接近FPI/SPI。因此，采用pH调节法可用于提取蛋白含量高和营养价值高的共沉淀蛋白。

[1] ALU’DATT M H, AL-RABADIB G J, ALLI I, et al. Protein co-precipitates: A review of their preparation and functional properties [J]. Food and Bioproducts Processing, 2013, 91(4): 327-335.

[2] YOUSSEF A M, ABU-FOUL N S, MOHARRAM Y G. Preparation and characteristics of coprecipitate proteins from oilseeds and legumes seeds [J]. Food, 1995, 39(5/6): 475-482.

[3] AL-SAADI J M S, DEETH H C. Preparation and functional properties of protein coprecipitate from sheep milk [J]. International Journal of Dairy Technology, 2011, 64(4): 461-466.

[4] HAGAN R C, DAHL S R, VILLOTA, R. Texturization of co-precipitated soybean and peanut proteins by twin-screw extrusion [J]. Journal of Food Science, 1986, 51(2): 367-370.

[5] ALU’DATT M H, ALLI I, NAGADI M. Preparation, characterization and properties of whey-soy proteins co-precipitates [J]. Food Chemistry, 2012, 134(1): 294-300.

[6] ESWARAPRAGADA N M, REDDY P M, PRABHAKAR K. Quality of low fat pork sausage containing milk-co-precipitate [J]. Journal of Food Science and Technology, 2010, 47(5): 571-573.

[7] LEAH C B, JOHN P C. Functional properties of co-precipitated protein isolates from cottonseed, soybean and peanut flours [J]. Canadian Institute of Food Science and Technology Journal, 1981, 14(4): 283-288.

[8] THOMPSON L U. Co-precipitation of cheese whey with soybean and cottonseed proteins using acid and heat-treatment [J]. Journal of Food Science, 2010, 43(43): 790-792.

[9] 张明成, 周凤超, 张春华, 等. 添加不同配比7 S/11 S大豆球蛋白对鸡肉丸品质的影响 [J]. 食品与发酵工业, 2016, 42(9): 137-142.

[10] 王晓英, 刘长姣, 段连海, 等. 双蛋白酸奶的开发研究进展 [J].中国酿造, 2014, 33(5): 18-21.

[11] 李来好, 郝淑贤, 魏涯, 等. 2种养殖模式罗非鱼肉品质的比较 [J].南方水产科学, 2013, 9(5): 1-6.

[12] NISHINARI K, FANG Y, GUO S, et al. Soy proteins: A review on composition, aggregation and emulsification [J]. Food Hydrocolloids, 2014, 39: 301-318.

[13] 张梦霞. 罗非鱼蛋白-大豆蛋白混合体系乳化性的研究 [D]. 湛江: 广东海洋大学, 2014.

[14] 刘慧清, 周春霞, 洪鹏志, 等. 罗非鱼头蛋白质的提取及性质研究 [J].食品与发酵工业, 2013, 39(2): 241-246.

[15] FAO/WHO/UNU expert consultation. Energy and Protein Requirements [M]. Geneva: WHO Technical Report Series,1985, 724:120-126.

[16] FOH M B K, XIA W S, AMADOU I, et al. Influence of pH shift on functional properties of protein isolated of tilapia (Oreochromisniloticus) muscles and of soy protein isolate [J]. Food and Bioprocess Technology, 2012, 5(6): 2 192-2 200.

[17] 王中江, 江连洲, 魏冬旭, 等. pH值对大豆分离蛋白构象及表面疏水性的影响 [J]. 食品科学, 2012, 33(11): 47-51.

[18] CHANNARONG C, JIRAWAT Y. Protein recovery of tilapia frame by-products by pH-shift method [J]. Journal of Aquatic Food Product Technology, 2013, 22(2): 112-120.

[19] 洪伟. pH值调节诱导鳄蛇鲻肌球蛋白分子展开/折叠行为的研究 [D]. 湛江: 广东海洋大学, 2014.

[20] HULTIN H O, KELLEHER S D. Surimi and Surimi Seafood [M]. New York: Marcel Dekker, 2000.

[21] KRISTINSSON H G, HULTIN H O. Changes in trout hemoglobin conformations and solubility after exposure to acid and alkali pH [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(11): 3 633-3 643.

[22] KRISTINSSON H G, HULTIN H O. The effect of acid and alkali unfolding and subsequent refolding on the pro-oxidative activity of trout hemoglobin [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(17): 5 482-5 490.

[23] WONG H W, LIU Q, SUNN S S M. Biofortification of rice with lysine using endogenous histones [J]. Plant Molecular Biology, 2015, 87(3): 235-248.