ADAMTS-1基因多态性及C反应蛋白在颈动脉斑块患者中的相关性研究

陈超 林冬铭 吴源鸿 黄抒伟

Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解蛋白样金属蛋白酶-1（ADAMTS-1）是一种新发现的金属蛋白酶，其金属蛋白酶结构区域含有锌离子（Zn2+）结合部位，是Zn2+依赖性金属蛋白酶家族的新成员[1]。ADAMTS-1基因rs402007位点位于第1外显子区，转录后为5′-UTR区，提示可能参与翻译调节，影响mRNA的稳定性、翻译效率等。前期研究发现ADAMTS-1基因rs402007位点多态性与脑梗死、冠心病等众多心脑血管疾病有关，但其具体机制还不清楚[1-2]；近来研究表明低度炎性反应伴随心脑血管疾病始终，两者之间相互影响，是一个恶性循环的关系[3]。C反应蛋白（CRP）在炎症反应中起重要作用，本研究旨在阐明ADAMTS-1基因多态性与血清CRP之间的关系，探讨ADAMTS-1基因多态性致颈动脉斑块形成的机制。

1 对象和方法

1.1 对象 2015年6月至2016年9月在我院体检中心检查的受试者684例，由2位高年资超声科医生进行颈动脉超声检查及诊断，根据检查结果有无斑块将其分为斑块组和对照组。斑块组383例，其中男 229例，女 154例，年龄 47～76（69.54±9.67）岁。对照组301例，其中男168例，女133例，年龄44～75（61.73±11.14）岁。所有的研究对象之间无亲缘关系。排除标准：有感染性疾病、急性脑梗死、急性心肌梗死、风湿性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、外伤性疾病、严重的肝肾疾病的患者。研究方案通过我院伦理委员会批准，全部研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 生化指标测定 抽取清晨空腹肘静脉血2ml至EP管，用美国Beckman公司生产的离心机（ALLEGRA X-12centrifuge）分离血清，分离好的血清标本储存于-80℃冰箱，避免反复冻融。ELISA法测定血清CRP水平。

1.2.2 基因组DNA抽提 用血液基因组DNA抽提试剂盒（上海捷瑞生物工程公司）提取基因组DNA，-80℃保存备用。

1.2.3 引物设计和PCR反应 从Ensembl数据库获得含有rs402007位点的ADAMTS1基因目的片段序列，输入Primer5.0软件合成引物（上游引物：5′-GGCGTCTTTGGGATGGAA-3′；下游引物：5′-CAGGAGACACCGCTCGTAG-3′）。反应体系 25μL包括1.0μl DNA模板，上下游引物各0.5μl，MixdNTP（10mmol/L）0.5μl，10×缓冲液 2.5μl，Taq DNA 聚合酶（5U/μl）0.25μl，Mg2+（25mmol/L）1.0μl，双蒸馏水18.75μl。反应条件：95℃2min，94℃45s，56℃45s，72℃1min，35个循环，72℃延伸 10min；1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像分析仪下分析。

1.2.4 测序和突变分析 对样本的PCR扩增产物用ABI-PRISM3730全自动测序仪进行检测，对琼脂凝胶中的目的DNA片段纯化后直接寄往上海生工生物有限公司测序部测序。

1.2.5 观察指标 比较斑块组与对照组两组间年龄、糖尿病、高血压、吸烟史、饮酒史、LDL-C、TG、TC、CRP、等位基因频率及基因型的差异；比较不同基因型及基因频率间CRP血清水平的差异。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件，计数资料之间比较采用χ2检验；计量资料以或四分位数表示，比较采用t检验或非参数秩和检验；采用二元logistic回归分析危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者一般资料比较 两组受试者糖尿病、高血压、吸烟、年龄、LDL-C比较差异有统计学意义（P＜0.05），饮酒、TG、TC 比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

表1 两组受试者一般资料比较[例（%）]

2.2 ADAMTS-1基因rs402007检测序列图 见图1。

2.3 两组受试者ADAMTS1基因型频率和等位基因频率比较 见表2。

由表2可见，斑块组GG基因型频率低于对照组，GC、CC基因型频率高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两组G、C等位基因频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组间rs402007位点均符合 Hardy-Weinberg 平衡（χ2＝0.643、0.205，P＝0.423、0.651）。

图1 ADAMTS-1基因rs402007检测序列图：CC/GC/GG；GG：野生纯合子；GC：突变杂合子；CC：突变纯合子

表2 两组受试者ADAMTS-1基因型频率和等位基因频率比较[例（%）]

2.4 ADAMTS-1基因型及等位基因致病风险分析见表3。

表3 ADAMTS-1基因型及等位基因致病风险分析

由表3可见，C等位基因携带者可使斑块发生的患病风险增加1.37倍；GC、CC与GG相比，分别使斑块患病风险增加1.416倍及1.812倍。

2.5 两组及各基因型间CRP的比较 斑块组血清 CRP 水平为 0.81（0.35，1.24）mg/L，高于对照组0.58（0.22，1.13）mg/L，差异有统计学意义（Z＝-3.667，P＝0.000）。GC组、CC组、GG组CRP水平分别为0.82（0.34，1.26）、0.94（0.42，1.45）、0.39（0.21，0.68）mg/L，其中GG组与GC组、CC组比较，差异有统计学意义（Z＝-6.794、-6.213，均P＜0.01）。此外，GG组与GC+CC组 0.91（0.31，1.47）mg/L 比较，差异有统计学意义（Z＝-8.384，P＜0.01）。

2.6 颈动脉斑块的多因素logistic回归分析 见表4。

由表4可见，ADAMTS-1 rs402007位点GC+CC基因型较GG基因型增加斑块患病风险（OR＝1.552；95%CI：1.093～2.203），此外高血压病史、年龄、LDL-C水平升高、吸烟也是斑块产生的独立危险因素。

表4 颈动脉斑块的多因素logistic回归分析

3 讨论

动脉粥样硬化是动脉壁炎性-纤维增生性病变，是导致急性心脑血管疾病发生的主要原因。遗传易感性及环境危险因素是目前动脉粥样硬化的防治重点[4-5]。研究已证实，ADAMTS-1基因rs402007位点C等位基因是急性大动脉粥样硬化性脑梗死的遗传易感基因，但其致病机制尚未完全清楚[1]。近年资料证明：CRP水平通过刺激胶原纤维和平滑肌增生，促使动脉血管壁结构改变，激活补体系统，大量炎症介质及自由基同时产生和释放，与动脉粥样硬化的发生、发展有密切的关系[6-7]。进一步推测ADAMTS-1基因rs402007位点G＞C突变可能通过调节血清CRP水平影响斑块发生、发展及稳定性，从而增加心脑血管疾病的患病风险。

本研究中我们应用病例-对照设计，进行ADAMTS-1基因多态性、血清CRP水平及颈动脉斑块3者之间的关联性研究。研究结果表明，斑块组血清CRP水平较对照组升高，差异有统计学意义，提示CRP水平与动脉粥样硬化病变过程相关。斑块组rs402007位点GC+CC基因型频率及C等位基因频率均较对照组高，logistic回归分析提示其为斑块形成的独立危险因素，C等位基因携带者患动脉斑块的风险较无C等位基因携带者高1.552倍，提示C等位基因是动脉粥样硬化及斑块形成的一个遗传易感等位基因。而C等位基因携带者血清CRP水平较无C等位基因携带者显著高，提示ADAMTS-1基因rs402007位点G＞C突变与炎症因子的表达有密切联系，证实了我们的推测。本研究结果显示rs402007位点G和C等位基因频率分别为0.572和0.428，符合浙江汉族人群的基因分布。

CRP是一种短链正五聚蛋白（PTX），主要在肝脏合成，在机体急性及慢性炎症中具有重要作用。而ADAMTS-1作为一种炎症相关蛋白，已被证实与炎症反应密切相关[8-9]。本次研究进一步发现ADAMTS-1基因rs402007位点G＞C突变与炎症因子CRP的表达有密切联系，分析原因，ADAMTS-1基因rs402007位点G＞C突变通过影响ADAMTS-1蛋白表达，一方面，直接刺激血管平滑肌细胞（VSMCs）释放CRP[10]；另一方面，激活单核巨噬细胞NADPH氧化酶，促进ROS产生，ROS可以活化促炎转录因子激活蛋白-1和NF-kB，诱导CRP的产生[11]。本次研究未涉及相关机制，因此在接下来的研究中，我们将从分子表达通路角度进行进一步研究。

综上所述，ADAMTS-1基因rs402007位点C等位基因是动脉粥样硬化及斑块形成的一个遗传易感等位基因；G＞C突变通过影响炎症因子的表达影响斑块发生、发展及稳定性增加心脑血管疾病的患病风险。

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（本文系第十一届钱江国际心血管病会议优秀论文）