灭幼脲对粘虫围食膜的影响及与其病毒的联合毒力作用

田晓丽， 卢文涛

(1.长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025；2.长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

【研究意义】粘虫Mythimnaseparata(Walker) 属鳞翅目，夜蛾科，是我国重要的粮食作物害虫，严重为害麦类、玉米、谷子、高粱、水稻等多种禾本科作物。同时，粘虫为典型的迁飞性害虫，每年会在我国南北方往返迁飞为害，属于“R对策”害虫。这类害虫往往会在其迁入地突然暴发成灾，需要及时防治，否则损失严重，甚至绝收。因此，速效性的化学农药是防治这种突发虫害的重要手段。然而，大量化学农药的使用必然会出现“3R问题”。目前，提高无公害生物防治的速效性是解决问题的有效途径之一。【前人研究进展】核型多角体病毒 (Pseudaletia Nuclear Polyhedrosis Virus，PsNVP) 是粘虫的重要病原微生物杀虫剂[1]。但是，实际田间防治效果不够理想，尤其对于需要迅速防治的“R对策”类害虫，存在毒力较低，杀虫效果表现缓慢的缺点，使其大田应用受到限制。因此，许多研究者寻找有效的增效剂以提高核型多角体病毒的速效性[2-5]。而衡量一个增效剂的优劣在很大程度上取决于它对昆虫围食膜的破坏效果。围食膜(Peritrophic membrane)是昆虫中肠内的一层非细胞薄膜状结构，位于食物和中肠上皮细胞之间，由中肠前端一直延伸至后肠，呈长筒状[6]。围食膜的主要功能之一是作为中肠上皮细胞和食物之间的有效屏障，防止昆虫摄取的粗糙食物对中肠上皮细胞的机械损伤，以及有效预防病毒、细菌等病原体对虫体的入侵。如果围食膜遭到破坏就会丧失其屏障功能，有利于病原生物的感染[7]。利用化合物对围食膜的破坏作用筛选增效剂已有部分研究，朱蓉等[3]研究了光增白剂对甜菜夜蛾围食膜结构的作用与影响；张小霞等[2]探究了刚果红对棉铃虫中肠围食膜的影响及其病毒增效作用；李怡萍等[5]研究了荧光增白剂对Cry1Ac抗感棉铃虫围食膜的影响及增效作用；吕敏等[4]探讨了天然产物梣酮对粘虫围食膜的影响。【本研究切入点】灭幼脲是一种昆虫生长发育调节剂，主要作用是抑制几丁质合成，从而使富含几丁质的表皮合成异常，蜕皮困难，以达到防虫的目的。昆虫围食膜同样含有几丁质，灭幼脲是否可以作为粘虫核型多角体病毒的增效剂，破坏围食膜的结构，提高这种病毒杀虫的速效性，值得研究。【拟解决的关键问题】本文旨在明确灭幼脲对粘虫中肠围食膜的破坏作用以及对粘虫核型多角体病毒增效作用，为开发高效，实用、环境友好型的微生物杀虫剂提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试虫和药剂

粘虫幼虫采自湖北省荆州市荆州区麦田；2.5×1011PIB/g粘虫核多角体病毒由中科院动物研究所农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室提供，准确称取1 g PsNVP、93 g滑石粉和6 g洗衣粉之后将各组分放入研钵中充分研磨混匀并过筛使其浓度调整为2.5×109PIB/g，然后制成20 %(质量体积比)的母液。20 %灭幼脲悬浮剂由吉林省通化农药化工股份有限公司生产。

1.2 正常围食膜电镜观察

将粘虫幼虫置于冰盘上剖取围食膜，用缓冲液漂洗剖取的围食膜至无色透明，无粘附物。放入盛有戊二醛固定液的青霉素小瓶中过夜，次日用磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min。然后用30 %、50 %、75 %、80 %、90 %、95 %丙酮脱水，各1次，每次10 min；100 %的酒精脱水2次，每次20 min。乙酸异戊酯置换2次，每次20 min。CO2临界点干燥后在真空喷镀仪内喷镀10～20 nm的金属膜，最后置于电子显微镜下观察围食膜表面形态结构并照相。

1.3 灭幼脲处理围食膜电镜观察

选取经饥饿24 h的粘虫6龄幼虫数头，饲喂以在20 %灭幼脲悬浮剂1000倍液中浸泡10 s并晾干的的小麦叶片，分别于粘虫幼虫取食36、72和96 h后将试虫放在冰盘上剖取围食膜进行电镜观察。(围食膜制样过程同上)。

1.4 灭幼脲与PsNVP联合毒力作用试虫处理

1.4.1 2个单剂毒力的测定 在预实验的基础上，将供试药剂用蒸馏水配成5～6浓度(1、6龄粘虫幼虫灭幼脲设133.33、100.00、80.00、66.67和 57.14 mg/L 5个浓度梯度，PsNVP设20.00、15.38、12.50、10.53和9.09 mg/L 5个浓度梯度；3、4、5龄粘虫幼虫 灭幼脲设400.00、200.00、 133.33、 100.00和80.00 mg/L 5个浓度梯度，PsNVP设20.00、15.38、12.50、10.53和9.09 mg/L 5个浓度梯度)，设清水为对照。将小麦片剪成长4 cm，宽1 cm的叶条，分别在各浓度药液中浸泡10 s，取出晾干，置于垫有滤纸的培养皿中(直径9 cm),每皿10片叶条，按不同虫龄接入粘虫幼虫10头，每个处理重复30次，实验3次。试验期间每天定时观察幼虫发育及存活情况。计算死亡率，校正死亡率。将粘虫的平均校正死亡率换算成机率值(y)，处理浓度(mg/L) 转换成对数值(x)， 根据浓度对数—死亡率机率值分析(Bliss)法[8]。求出毒力回归方程和致死中浓度LC50的值。

1.4.2 增效作用的测定 预先测定灭幼脲和SeMNPV不同配比复合物有效致死浓度范围后，灭幼脲和SeMNPV按1∶8；1∶9；1∶10；1∶12；1∶14比例混配，每个配比的药液按上述方法进行毒力测定5个配比的混剂进行室内毒力测定，根据孙云沛Sun-Johnson方法，计算各混剂的共毒系数(Co-toxicity Coefficient CTC)[9]。然后根据CTC决定最佳配比。若混剂的共毒系数接近100，表示此混剂的作用是相加作用；若共毒系数显著>100，表示有增效作用；若共毒系数<100，则表示有拮抗作用。

1.5 数据处理

采用DPS系统进行数据处理。

实测混剂的毒力指数(ATI)=

理论混剂的毒力指数(ATI)=A毒力的指数×A在混剂中占的百分率+B毒力的指数×B在混剂中占的百分率。

2 结果与分析

2.1 灭幼脲处理对围食膜外部形态的影响

解剖实验发现，健康粘虫幼虫围食膜富有弹性，呈无色透明管状结构，包裹着食物。扫描电镜观察表明，健康粘虫幼虫围食膜表面光滑，结构致密有序，除有一些细小的皱褶外，没有间隙，这种结构和形态保证了围食膜对昆虫中肠的防护功能(图1-A)。解剖实验发现，灭幼脲处理后的粘虫幼虫围食膜出现明显病变(图1-E)。灭幼脲对粘虫幼虫处理36、72、96 h的围食膜电子扫描电镜观察发现：灭幼脲处理36 h后，围食膜表面结构明显变的粗糙，易出现一些凹沟和细缝(图1-B箭头示)。灭幼脲处理后72和96 h，围食膜已经明显变薄，颜色逐渐加深，凹沟和细缝进一步增大，并随着时间的延长有加重的趋势(图1-C和D)。

2.2 灭幼脲与PsNVP单剂及联合毒力作用

2.2.1 灭幼脲和PsNVP单剂对粘虫幼虫的毒力作用 表1显示：灭幼脲与PsNVP对粘虫2龄幼虫的LC50分别是72.44和12.02 mg/L；灭幼脲与PsNVP对粘虫6龄幼虫的LC50分别是123.03和12.58 mg/L；灭幼脲与PsNVP对粘虫3龄幼虫的LC50分别是223.87和17.78 mg/L；灭幼脲与PsNVP对粘虫4龄幼虫的LC50分别是263.02和19.05 mg/L；灭幼脲与PsNVP对粘虫5龄幼虫的LC50分别是245.47和15.85 mg/L。从半致死浓度LC50可以发现，2龄幼虫和6龄幼虫的LC50明显低于3、4、5龄幼虫，说明2、6龄幼虫对这两种药剂的敏感性高于3、4、5龄幼虫。

A.正常围食膜电镜照片；B．灭幼脲饲喂36 h后的围食膜电镜照片；C．灭幼脲饲喂72 h后的围食膜电镜照片；D．灭幼脲饲喂96 h后的围食膜电镜照片；E. 灭幼脲饲喂96 h后的试虫围食膜照片A. SEM photo of the peritrophic membrane of M. separate; B．SEM photo of the peritrophic membrane of M. separata reared with 20 % Diflubenzuron after 36 hours; C．SEM photo of the peritrophic membrane of M. separata reared with 20 % Diflubenzuron after 72 hours; D. SEM photo of the peritrophic membrane of M. separata reared with 20 % Diflubenzuron after 96 hours; E. Photo of the peritrophic membrane of M. separata reared with 20 % Diflubenzuron after 96 hours图1 粘虫6龄幼虫的围食膜电镜照片Fig.1 The peritrophic membrane of the 6th instar larva of M.separata

表1 灭幼脲和PsNVP单剂对粘虫幼虫的毒力

注：A——灭幼脲；B——粘虫核多角体病毒。

表2 灭幼脲与PsNVP混配对粘虫幼虫的联合毒力

注：A——灭幼脲；B——粘虫核多角体病毒。

2.2.2 灭幼脲和PsNVP混配对粘虫幼虫的毒力作用 从表2可以看出，灭幼脲与PsNVP混合对粘虫各龄幼虫均表现出不同程度的增效作用。其中对4龄幼虫在混配比例1∶9的时候，增效作用最明显，共毒素数达353，显著提高了杀虫的速度和效果，这对于弥补灭幼脲类杀虫剂对高龄幼虫药效低和病毒制剂杀虫时间长的缺点具有一定参考作用。同时试验发现，两者混用对3和5龄幼虫的增效作用也较好，共毒系数分别为302和304，再次是对2和6龄幼虫，共毒系数分别为125和209。

3 讨 论

围食膜是昆虫中肠内的一层非细胞薄膜状结构，由粘多糖、蛋白质和几丁质构成，是昆虫抵御随食物摄取的有害微生物入侵的第一道屏障。因此，通常作为研究病原微生物入侵虫体的潜在靶标[10-11]。灭幼脲杀虫剂是一类几丁质合成抑制剂。这类昆虫生长调节类杀虫剂可以减低O-糖苷键对围食膜的保护，阻止其几丁质的合成[10]。本研究发现，健康粘虫围食膜富有弹性，表面光滑，没有间隙；而灭幼脲处理后的围食膜明显变薄，表面较粗糙，易出现细小裂隙，并随处理时间的延长有加重的趋势。这可能与灭幼脲抑制了围食膜几丁质的合成有关[12-13]。据此推断，PsNVP+灭幼脲混剂的灭幼脲进入昆虫中肠后应该能够降低围食膜的厚度，促进PsNVP的入侵，提高PsNVP的毒力。本研究中，对3～5龄粘虫幼虫的生测结果验证了这一推断，即 灭幼脲对PsNVP具有明显增效作用。但是对于2、6龄幼虫，该混剂并没有表现出明显的增效作用。根据表1的LC50值，认为这是由于药剂对2、6龄幼虫的毒力明显高于3～5龄幼虫所致，换言之，2和6龄幼虫对药剂具有较高敏感性。其中，2龄幼虫对药剂的高敏感性可能是由于体内解毒酶活性比较低，对杀虫剂的解毒代谢能力弱。但对6龄幼虫原因可能来自两个方面，一方面，6龄幼虫取食能力逐渐减弱，代谢机能降低，体内解毒酶的活性下降，从而对药剂的抗性逐渐减弱[11, 14]。另一方面，末龄幼虫即将化蛹，而不再大量取食，使得围食膜的合成受到影响，从而削弱了其屏障的功能，促进了病毒的入侵[2]。

筛选昆虫病毒的有效增效剂是解决病毒类杀虫剂作用速度效果缓慢，杀虫谱窄和活性低等问题的重要途径之一。一方面，可明显提高这类生物杀虫的速效性，减少用量、降低成本；另一方面，也能有效缓和大量使用化学药剂所带来的“3R问题”。目前，在实际生产中也普遍存在其他药剂与昆虫病毒混合使用的现象，但是大多以化学药剂为主要成分。由于这种不合适的药剂和配比，使得昆虫病毒还未发挥功效，害虫已经神经中毒死亡，这本质上还是化学杀虫剂的单独作用[15]。这样的混剂不但起不到预想效果，反而浪费了昆虫病毒加重了害虫的抗药性。本实验将昆虫病毒PsNVP与灭幼脲混用，既保持了生物农药的速效性，又保证了对抗性害虫的特异性，并且对人畜无害，不造成环境污染。这对于拓宽害虫生物综合防治具有一定意义。

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