湖北省水稻白叶枯病菌致病型分化检测与分析

袁斌 刘友梅 黄薇 张舒 吕亮 常向前 杨小林

摘要：为了掌握湖北省水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的致病型分化和变异动态，采集湖北省水稻种植区白叶枯病样品分离白叶枯病菌，用含不同白叶枯病抗性基因的近等单基因系IRBB2、IRBB3、IRBB5、IRBB13、IRBB14和IR24作为鉴别寄主，采用剪叶接种，根据寄主和分离菌株的互作反应检测病菌的致病型分化。鉴定结果表明，在湖北省水稻白叶枯病的致病型R9（SSSSSS）占鉴定菌株的46.2%，还有Unknown类型的菌株占38.5%。与前人研究结果相比，湖北白叶枯病菌致病型发生了很大的变异，主要致病型由R4变成了R9，且出现了以前没有的R8（SSRSSS）类型和Unknown类型。同时，鉴定了Xa7和Xa23介导的湖北省白叶枯病菌的抗性，Xa7有2个分离菌株可以克服其抗性，而Xa23能抗所有分离菌株，因此在湖北省可以利用这2个基因进行水稻抗白叶枯病育种。

关键词：水稻;白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）;致病型

中图分类号：S435.111.4+7         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）24-0100-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.028           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： In order to understand the pathogenic differentiation and variation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in Hubei province，pathogenic isolates were collected from rice growing areas in Hubei province. Near isogenic lines IRBB2，IRBB3，IRBB5，IRBB13，IRBB14 and IR24 carrying different resistance genes were used to detect pathogenic differentiation. Leaf-clipping method was used to detect pathogenic differentiation of the pathogen according to the interaction between the host and the isolates. The results showed that the pathotype R9（SSSSSS） of rice bacterial blight was 46.2%，and the unknown strains were 38.5%. Compared with the results of previous studies，the pathotypes of bacterial blight in Hubei province had undergone considerable variations， and the main pathogenic form was changed from R4 to R9，with the emergence of R8 （SSRSSS） types which wasnt detected and unknown types. At the same time，Xa7 and Xa23 mediated resistance were identified. A few strains of Xa7 gene could be overcome，while Xa23 could resist all strains. Therefore，these two genes could be used in rice breeding for resistance to bacterial blight in Hubei province.

Key words： rice; Xanthomonas oryzae pv. Oryzae; pathotype

作为水稻三大病害之一的白叶枯病，曾经造成湖北省水稻生产的巨大损失[1]。随着水稻抗白叶枯病品种的应用、综合防治措施的推广以及环境条件的变化等，白叶枯病由以前的常发病害变成了偶发病害，致使水稻生产上忽略了白叶枯病的防治，所以偶发也可能造成大的损失。在先前的研究中，分析了近年来湖北省水稻主栽品种对白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的抗性，表明多数品种只能抗白叶枯病少数株系，而对致病型强的株系大多数缺乏抗性[2]。其中的原因就有随着白叶枯病为害下降，育种家普遍轻视针对白叶枯病的抗性育种。水稻品种对白叶枯病抗性的丧失将是導致白叶枯病暴发的潜在危险。本研究分析了湖北省白叶枯病菌致病型的变化，对白叶枯病菌致病型动态变异的监测有利于选择合适的抗病基因用于水稻白叶枯病抗性育种[3]。同时，分析了Xa7与Xa23这2个白叶枯病抗性基因在湖北省水稻抗白叶枯病育种上的利用价值。

1  材料与方法

1.1  鉴别品种与种植

选用国际水稻所育成的分别含有不同白叶枯病抗性基因的近等单基因系IRBB2（Xa2）、IRBB3（Xa3）、IRBB5（xa5）、IRBB13（xa13）、IRBB14（Xa14）和IR24（S）作为鉴别品种对分离的白叶枯病菌进行致病型检测[4]。同时，接种IRBB7（Xa7）和CBB23（Xa23）两个品种。

所有品种分别种植于湖北省农业科学院植保土肥研究所试验场，每个品种种植150株左右，单本插植，肥水管理与大田相同，防虫不防病。

1.2  白叶枯病菌收集与分离

2013—2016年，收集湖北省水稻白叶枯病病叶，并分离病菌。采用稀释平板法进行[5]。剪取新鲜发病的叶片中包含有病健交界处6 cm片段，用75%乙醇表面消毒30 s，转移到0.1%氯化汞溶液中表面消毒5 min，用无菌水冲洗3次，每次1 min。剪碎处理过的叶片，置于加有1 mL灭菌水的灭菌研钵中磨碎，取100 μL溶液加入到900 μL的灭菌水中，逐级稀释，取100 μL相应梯度的稀释液涂于NA平板中，于28 ℃恒温箱中培养2～3 d，挑取典型的单菌落摇菌。取出一定量的菌液于灭菌的1.5 mL离心管中，加入50%的灭菌甘油，终浓度为15%，保存于  -80 ℃冰箱中备用。

1.3  白叶枯病菌接种与调查

将保存的白叶枯病菌从-80 ℃中取出，在NA培养基平板上划线，置于28 ℃培养3 d活化，再挑单菌落在NA培养基平板上划线培养3 d。用灭菌水洗脱平板上菌体，利用比浊法配制成3×108 CFU/mL细菌悬浮液。采用剪叶接种法，接种完全展开的剑叶[4]。每个菌株接种各个品种10株，每个单株接种4～5片剑叶。

接种21 d后，测量接种叶片的病斑长度或估测病斑面积，参照方中达等[6]的研究结果进行抗性分级（表1）。

2  结果与分析

2.1  湖北省部分地区白叶枯病发病概况

2013—2016年湖北省水稻种植区白叶枯病发生很轻，大部分水稻种植区都没有白叶枯病的发生，采集样品的地点详见表2。从这些样品中分离到13个菌株，其中有6个菌株分别在2013、2015和2016年来自湖北省农业科学院粮食作物研究所水稻试验田，5个菌株分别于2014和2015年来自华中农业大学水稻试验田，而仅在2015年在黄冈黄梅采集到白叶枯病样品。分析近年来湖北省水稻种植区白叶枯病危害减少的原因可能是：一方面大部分品种对白叶枯病菌有一定的抗性，尽管先前的研究表明湖北省主栽品种对强毒性菌株FuJ和YN1缺乏抗性[2]，但是这样的强毒性菌株并没有在湖北省水稻种植区传播开来。另一方面流水在白叶枯病菌的传播中起着重要作用，淹涝往往导致白叶枯病大面积发生。以往，湖北省各地洪涝灾害频发，近年来，大型水利设施以及各地水利设施的修建并投入使用，使得湖北省发生洪涝灾害的危害大大减轻，也很大程度上减少了病菌的传播[7，8]。

2.2  湖北水稻白叶枯病菌在鉴别寄主上的致病型

分离到的13个菌株分别接种水稻白叶枯病抗性基因近等单基因系上的致病反应结果见表3，依据表1的反应类型，将13个菌株划分为R8（SSRSSS）类型的有2个菌株，占所有菌株的15.4%;划分为R9（SSSSSS）类型的有6个菌株，占所有菌株的46.2%;还有5个菌株未能划分到相应的致病类型，占所有菌株的38.5%，根据它们对近等基因系的抗病反应又可以分为2个类型：SRSSSS和SRRSSS。其余8种类型在本次试验中并没有鉴定到。

先前的研究表明，湖北省水稻白叶枯病菌的优势致病型为R4，未发现R7和R8 2个致病型的菌株[9]，而本研究结果显示R8致病型在湖北省已经出现，且R9强致病小种占有优势，不仅如此，还有5个菌株不能归类为已知的致病型，这5个菌株分别属于3个不同的地方。这表明湖北省白叶枯病致病优势菌株已经发生大的改变。

2.3  Xa7和Xa23白叶枯抗性基因对湖北省水稻白叶枯病菌的抗性

为了明确白叶枯抗性基因Xa7和Xa23在湖北省水稻抗白叶枯病育种上的利用价值，以及更为准确地区分白叶枯菌株的致病类型，在本试验中增加了IRBB7和CBB23两个品种，分别携带有Xa7和Xa23白叶枯抗性基因。结果（表4）表明，所测试的13个菌株对CBB23都不致病，而13WH-C和13WH-E 2个菌株对IRBB7致病，而這2个菌株在鉴别品种上鉴定为R9和R8类型，其余11个菌株表现为不致病。增加新的单基因系到鉴别品种中，可以提高白叶枯病菌致病型的鉴别能力，有利于对白叶枯病菌致病型的区分，为白叶枯病菌致病型的鉴定提供更为准确的信息。

2.4  同区域不同年份分离的菌株的致病型变化

采集的病菌菌株主要来源于湖北省农业科学院粮食作物研究所水稻试验地6个菌株（2013、2014和2016年各2个）和华中农业大学水稻试验地5个菌株（2013年3个，2014年2个）。不同年份的菌株致病型存在差异。2块试验田里每年分离到对所有鉴别品种都致病的小种R9（SSSSSS）菌株，随着年份的变化出现了以前没有监测到的R8类型和Unknown类型，表明田间的白叶枯病菌菌株致病型存在多样性和变异。为了进一步明确这一点，分离更多的白叶枯病菌进行分析是有必要的。

3  小结与讨论

利用含不同单一白叶枯病抗性基因的6个水稻近等基因系鉴定白叶枯病菌的致病型，将2013—2016年湖北省水稻白叶枯病菌鉴定为R8和R9两种类型以及Unknown类型，而R9和Unknown类型是优势致病型。这与以前的研究结果不同，先前的研究显示武汉地区的优势致病型为R4，黄冈地区的优势致病型为R3、R4，而在本研究中R3、R4这2个类型没有出现，还鉴定出曾经认为没有的R8和Unknown类型的菌株[9]。推测可能的原因是本试验采集样品的地点常年用来作育种基地，种植的都是育种材料，对白叶枯病菌进行了选择，导致白叶枯病菌致病型发生了变化所致，但是这并不能解释黄冈地区出现的Unknown类型。病原物致病型的变异往往导致抗病品种抗性丧失，因此，准确监测白叶枯病致病型的变化是防止白叶枯病再次成为水稻生产严重威胁的必要保证。

本试验结果表明，当前所用的6个单基因近等基因系对白叶枯病菌的致病型区分能力有限，不能将所有分离到的菌株鉴定到不同的致病型。试验增加的IRBB7和CBB23 2个单基因品种，一方面增加了鉴别品系的区分能力，另一方面鉴定Xa7和Xa23 2个基因在湖北省水稻抗白叶枯病育种上的利用价值。Xa23白叶枯病抗性基因可以抗所有分离的菌株，是湖北省水稻抗白叶枯病育种可以利用的优良抗性基因;而Xa7可以抗绝大部分白叶枯分离菌株，在育种上也是可以利用的抗性资源。

参考文献：

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