circRNA、microRNA与低氧性肺动脉高压的相关性研究进展

夏世金 王 坚 邰先桃 王厚融

(复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所，上海 200040)

低氧性肺动脉高压(HPH)是对人的健康危害极严重、治疗难度极大、致死率和致残率极高的病理生理综合征，故有“假恶性”肿瘤之称〔1〕。HPH发生机制一直是医学研究的热点和难点〔2〕。中国40岁以上人群中COPD患病率高达8.2%，大多数COPD患者(尤其是老年患者)最终由HPH发展为肺心病〔3〕。HPH是COPD发展到肺心病的中心环节。深入研究并阐明HPH发生发展机制，对有效防治HPH和预防COPD进展为肺心病具有重大意义。

1 microRNA与HPH

低氧性肺血管结构重建(HPVSR)是HPH形成的基本病理生理特征之一〔4〕，低氧可致肺动脉平滑肌细胞(PASMC)由收缩型向合成型转化、PASMC异常增殖加速和凋亡减慢、肺血管阻力增加和肺动脉压升高。PASMC异常增殖加速和凋亡减缓在HPVSR中起着关键作用。治疗HPH策略已从单纯舒张血管平滑肌降低肺动脉压力转变到抑制血管异常增生和肺血管结构重建。阐明低氧性PASMC异常增殖与凋亡在HPVSR中的作用与机制，对寻求有效防治HPH新策略意义重大。虽然从经典遗传学角度探索HPH机制已经取得可喜进展，但HPH的机制依然未完全阐明，HPH的有效防治依然未彻底解决，遭遇困境。然而，近年生机勃勃的表观遗传学将为阐明HPH机制带来新希望。表观遗传调控几乎存在于生物调控所有环节〔5〕。即使去除干预因素，表观遗传修饰也可长时间保持稳定并维持调控基因的表达水平。所以，表观遗传学在阐明疾病发生机制方面展示其独特优势和巨大潜力。

当前表观遗传学中研究非常活跃的一个重要调控机制是microRNA(miRNA)。miRNA是一类高度保守的非编码RNA(ncRNA)。miRNA选择性结合到RNA诱导的沉默复合体上，并通过碱基互补配对与靶mRNA 3′非翻译区(3′-UTR)特异序列结合，抑制mRNA翻译或将其降解，负性调控靶基因的表达〔6，7〕。miRNA在HPH的形成中发挥着重要作用。在HPH模型大鼠肺中miR-451等表达上调和miR-22等表达下调〔8〕。miR-145/-143是平滑肌细胞高表达的一组miRNA，被称为血管平滑肌细胞标志物，是促进平滑肌细胞分化和稳定表型的重要分子开关〔9〕。miR-21在低氧刺激的人PASMC中表达上调，通过抑制PDCD4等多个靶基因促进细胞增殖与迁移〔10〕。在HPH患者血液中miR-23b等表达显著上调，miR-1等表达明显下调〔11〕。然而，用miRNA研究策略试图阐明HPH发生机制依然困难重重。可喜的是，最近越来越备受关注的、miRNA的内源性竞争RNA(ceRNA)——环状RNA(circRNA)为明确HPH发生发展机制、阐明早期干预靶点及诊断生物学标志物提供新方法和新策略〔12〕。

2 circRNA与HPH

circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，是RNA家族的新成员和研究最新热点。近年国际顶级刊物Nature发表了有关circRNA生物学功能的论文〔13，14〕，使得研究者对circRNA高度关注，掀起研究热潮。

circRNA由特殊可变剪接产生，存在于真核细胞胞质，呈现组织、时序和疾病的特异性。circRNA分子由于是封闭的环状结构，所以不受RNA外切酶的影响，表达更加稳定，而且不易降解。circRNA在机体组织细胞和血液中表达〔12〕。circRNA与疾病关联的miRNA发生相互作用，调控疾病的发生，为阐明疾病发生机制、确立诊断标志物和干预靶点提供强有力的手段。circRNA目前最具共识的是通过吸附miRNA(即miRNA sponge，miRNA海绵)机制发挥其功能〔12〕(见图1)。由于circRNA分子富含miRNA应答元件，可通过与miRNA发生海绵作用，进而削弱miRNA对其下游靶基因的抑制效果，上调下游靶基因的表达〔14〕。研究发现，circRNA CDR1as具有至少60个miR-7结合位点，充当miR-7的海绵，可影响miR-7的靶基因活性〔14〕。在发育的中脑中CDR1as和miR-7有共同高表达的特征。在斑马鱼胚胎中，CDR1as过表达造成中脑体积变小，而通过注射miR-7前体后中脑体积得以部分恢复，表明CDR1as的生物学功能至少部分是通过CDR1as与miR-7的相互作用而产生〔14〕。CDR1as是miR-7的环状抑制剂，负性调控miR-7，从而影响肿瘤的发生〔14〕，发挥天然miRNA海绵功能〔15〕。CDR1as可能与帕金森病的发生相关〔16〕。当ciRS-7(也被称为CDR1as)的海绵功能缺失时，miR-7表达上调，极有可能下调阿尔茨海默病相关蛋白(如泛素化蛋白连接酶A)的表达〔17～19〕。睾丸特异性基因Sry 的circRNA具有16个miR-138的靶位点，充当miR-138海绵〔14〕。circRNA cANRIL是基因INK4/ARF的反义转录物〔20〕，可通过差异的PcG募集来抑制INK4/ARF表达，进而参与调控动脉粥样硬化的发生〔21〕。

(A)circRNA作为miRNA的环状抑制剂，充当miRNA海绵；(B)circRNA与蛋白结合；(C)circRNA与其他RNA通过碱基互补配对结合图1 circRNA的主要功能示意图〔12〕

作者前期研究发现〔22〕：(1) 芯片筛选实验：对HPH模型小鼠肺组织进行circRNA芯片筛选，结果发现：HPH模型组(与常氧组比较)小鼠肺组织中circRNAs表达显著上调有23个，显著下调有41个。(2)RT-PCR肺组织验证实验：接着挑选芯片筛选出的差异表达circRNAs中上调或下调倍数相差较大的12个circRNAs(上调或下调各6个)进行RT-PCR验证，结果发现：HPH模型组小鼠肺组织中circRNAs表达显著上调(与芯片结果完全一致)有5个(mmu_circ_0000410、mmu_circ_0001209、mmu_circ_0000173、mmu_circ_0001898、mmu_circ_0000007)，显著下调(与芯片结果完全一致)有2个(mmu_circ_0001033、mmu_circ_0001724)(根据circBase数据库circRNA ID命名)。这项创新性的研究结果预示着circRNA之矛将有可能戳穿HPH发生机制之盾。作者的新近研究发现：(1)RT-PCR细胞验证实验：基于上述芯片结果，以常氧(对照)和低氧性的小鼠PASMC标本为检测对象，对上述相同的12个差异表达的circRNAs再次进行RT-PCR验证，结果表明，低氧性PASMC中circRNAs表达显著上调有3个(mmu_circ_0000410、mmu_circ_0000173、mmu_circ_0000007)、显著下调也有3个(mmu_circ_0001033、mmu_circ_0001724、mmu_circ_0000543)，与芯片检测和肺组织RT-PCR验证的高度一致。(2)circRNA过表达慢病毒构建与转染小鼠PASMC实验：成功构建了mmu_circ_0001033过表达慢病毒载体，并且成功高效转染入小鼠PASMC，运用CCK-8法检测PASMC增殖，结果发现过表达的mmu_circ_0001033 可显著抑制低氧所诱导的PASMC异常增殖。(3)circRNA、miRNA和mRNA三者之间关系研究：利用生物信息学技术和HPH相关miRNAs文献整合分析发现，能够与mmu_circ_0001033和mmu_circ_0000410结合的miRNAs有5条，预测这5条miRNAs的结合力最强的靶基因有30个，构建了circRNA-miRNA-mRNA三者之间关系网络图。基于上述实验结果，结合circRNAs预测吸附的与HPH高度相关的miRNAs，综合分析，从上述差异表达的circRNAs中，作者最终精选出mmu_circ_0001033和mmu_circ_0000410作为重点研究对象。

整合上述研究积累、HPH研究进展与作者前期相关研究的结果，凝炼出关键科学问题：circRNA是否参与HPH的发生？circRNA调节HPH的机制是什么？circRNA所吸附的miRNA的下游与HPH发生相关的靶基因有哪些？进而提出假设：(1)circRNA可调节HPH的发生；(2)circRNA可通过miRNA海绵(吸附miRNA)，以降低miRNA对其下游靶基因mRNA和蛋白表达的调控，发挥circRNA调节HPH的作用机制(见图2)。为验证上述假设，进而解决关键科学问题，拟制定的研究内容：(1)建立HPH小鼠和低氧性PASMC模型，构建circRNA的shRNA或过表达慢病毒载体，从而下调或上调目的circRNAs表达，观察慢病毒转染后小鼠HPH特征及细胞增殖与凋亡等变化，明确circRNA调节HPH的生物学功能；(2)运用RIP-PCR等方法明确circRNA与miRNA的结合关系，以及观察circRNA/miRNA内源性竞争影响miRNA下游靶基因的表达变化与信号通路调控，明确circRNA、miRNA和mRNA三者的关系，探明circRNA的miRNA海绵机制；(3) 利用荧光素酶报告基因实验等探索circRNA、miRNA和mRNA之间的直接结合情况，深度阐明circRNA调节HPH的分子机制；(4)运用HPH患者的血标本验证目的circRNAs，确定HPH生物标志物。为阐明HPH的机制、确定临床诊断生物标志物和干预靶点提供依据。

图2 circRNA通过miRNA海绵调节miRNA下游靶基因表达从而调节HPH假设图

总之，circRNA、microRNA与HPH三者之间具有密切的联系，深入阐明circRNA和microRNA在HPH发生发展中的作用，为明确HPH发生发展机制提供新策略和新方法。

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