不同剂量右美托咪定对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达的影响

方 洁

(河南中医药大学第一附属医院麻醉科，河南 郑州 450000)

脑部对缺血缺氧敏感性高，缺血后再灌注导致脑部出现严重的不可逆损伤，同时多种高危风险手术潜在发生脑缺血的风险，脑部病变位置易发生炎症、神经元变性和氧化应激等，这是导致患者死亡的重要原因〔1〕。目前临床上常采用再灌注疗法，通过血液再灌注使脑组织的缺血缺氧部位代谢恢复正常，同时加速代谢产物的清除速度，但是治疗窗窄，仅有一小部分患者适用此法〔2〕。近几年研究发现〔3，4〕，右美托咪定(DEX)对于脑缺血再灌注损伤的脑组织具有保护作用，不仅能够降低儿茶酚胺的生成量，而且能够下调兴奋性神经递质谷氨酸的释放量。临床上对于DEX治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制研究较多，但是具体的用药剂量及是否存在剂量依赖性尚未明确。本研究通过不同剂量的DEX干预脑缺血再灌注大鼠血清及脑组织中相关因子水平变化。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 SPF级健康SD大鼠60只，雌雄各半，周龄7～10 w，体重220～250 g，由郑州大学实验动物中心提供，饲养于洁净级环境中，自由饮食，饲养室温度(23±2)℃，相对湿度55%～60%，换气8～12次/h，保持光线每隔12 h交替，实验前适应性饲养7 d。按照随机数字表法。将大鼠分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、低剂量DEX组、中剂量DEX组和高剂量DEX组，每组12只。

1.2造模及给药方法 造模方法参考Longa等〔5〕记载的大鼠大脑中动脉阻塞缺血再灌注模型。试验前用3.6%水合氯醛腹腔注射10 ml/kg进行麻醉，将大鼠仰卧位固定四肢，切开颈部右侧正中皮肤，做一2～3 cm的切口，使得右侧颈总动脉充分暴露，钝性分离颈内动脉和颈外动脉至分叉处，并用眼科剪子细分离周边组织，同时避免损伤迷走神经和气管，使用3号线结扎颈总动脉和颈外动脉，在颈总动脉处用2 ml注射器扎一小孔，使用3-0尼龙线从小孔插入颈内动脉约18 mm，轻微感到阻力后，将颈内静脉结扎并固定尼龙线，在颈中动脉外置留0.5 cm尼龙线，从而阻断右大脑中动脉入口，使得大脑右侧中动脉供血区形成缺血区域，阻断2 h后拔出线栓进行再灌注，逐层缝合皮下组织和皮肤，脑缺血再灌注模型造模完毕。造模成功的标志为阻断血流成功1 min后，大鼠瞳孔扩大，颜色苍白，呼吸速度加快，恢复血流灌注后，瞳孔颜色恢复为鲜红色。Sham组大鼠只进行分离血管，并不插线栓，术中持续静脉泵入生理盐水2 h，速度2 ml/h；I/R组大鼠造模完毕后持续静脉泵入生理盐水2 h，速度2 ml/h；DEX组中DEX均使用生理盐水稀释，低剂量DEX组大鼠造模完毕后，首次静脉输注6 μg/kg DEX，10 min内完成，同时剩余的DEX以0.05 μg·kg-1· min-1速度持续静脉泵注2 h，输注速度为2 ml/h；中剂量DEX组大鼠造模完毕后，首次静脉输注60 μg/kg DEX，10 min内完成，同时剩余的DEX以0.5 μg·kg-1· min-1速度持续静脉泵注2 h，输注速度为2 ml/h；高剂量DEX组大鼠造模完毕后，首次静脉输注600 μg/kg DEX，10 min内完成，同时剩余的DEX以5.00 μg·kg-1· min-1速度持续静脉泵注2 h，输注速度为2 ml/h。

1.3观察指标 造模结束后，评估各组大鼠神经功能缺损程度。各组大鼠在脑缺血再灌注24 h后进行麻醉，从右心室采血3 ml，置于未涂肝素钠的离心管中，立即离心，3 500 r/min离心10 min，取上清液，置于-20℃冰箱中待测，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β及细胞间黏附分子(ICAM)-1的表达水平，试剂盒由美国R&D公司提供，严格按照说明书进行操作。另外，麻醉后断头去脑，置于-80℃冰箱中，除去小脑及脑干等位置，剩余部分采用冠状位切片，从额极向后切片，厚度为2 μm，应用双氧水处理10 min，然后使用非免疫血清封闭15 min，加入兔抗鼠一抗(购自武汉博士德生物工程有限公司)，在室温下过夜反应，接着使用PBS洗脱，避光条件下，采用DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)进行显色，使用光镜观察。放大200倍，应用MAS2图像分析系统对脑组织中TNF-α、IL-1β及ICAM-1在单位视野中表达阳性的积分光密度。另外将部分脑片置于2% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃避光孵育30 min，孵化结束后照相，使用AutoCAD软件计算染色结果，统计梗死区域面积。

1.4神经功能评分标准〔6〕在大鼠清醒后，对神经功能缺损程度进行评估，共分为五个等级：0分，神经功能无缺损；1分，左前爪不能伸直；2分，行动过程中向左侧旋转；3分，行动过程中身体向左侧倾斜；4分，自主行动能力和意识丧失。

1.5统计学方法 应用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组神经功能评分和梗死区域面积比较 造模大鼠均出现了一定程度的神经功能缺损和梗死面积。与Sham组相比，其他各组大鼠神经功能评分及梗死面积均明显更高，同时高、中、低剂量DEX组大鼠神经功能评分及梗死面积均显著低于I/R组(P<0.05)，不同剂量DEX组大鼠神经功能评分及梗死面积之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组神经功能评分和梗死区域面积比较

与Sham组相比：1)P<0.05；与I/R组相比：2)P<0.05，下表同

2.2各组血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达水平比较 与Sham组相比，其他各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达水平均明显升高(P<0.05)；与I/R组相比，高、中、低剂量DEX组大鼠血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达水平显著降低(P<0.05)，不同剂量DEX组大鼠血清中各检测指标之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3各组脑组织中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达水平比较 其他各组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达水平均明显高于Sham组，同时高、中、低剂量DEX组大鼠血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达水平显均著低于I/R组(P<0.05)，但是不同剂量DEX组大鼠血清中各检测指标之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达水平对比

表3 各组脑组织中TNF-α、IL-1β及ICAM-1表达水平比较

3 讨 论

临床脑缺血再灌注损伤患者发生危急症状时，即使得到有效的治疗后，患者依然存在意识障碍，可导致患者心肺衰竭，甚至成为植物人，这些均是由脑缺血再灌注损伤所致。脑缺血再灌注损伤作为一个十分复杂的病理过程，其中多种因素参与其中，包括炎症反应、兴奋性神经毒性、自由基损伤、Ca2+超载及膜脂质过氧化等，其中炎症反应是造成脑缺血再灌注损伤的重要原因〔7〕。炎症反应是机体对抗外界危险因素和维持内环境稳定的保护机制，同时又可能导致机体损伤，血脑屏障通透性增加后，大量的炎性因子通过血脑屏障加重脑缺血程度〔8〕。另外有研究证实，患者一旦出现脑缺血，体内的炎性反应能够导致脑组织发生继发性损伤，在此基础上，多种因素的相互作用，诱发缺血再灌注损伤〔9〕。本研究说明脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织中炎性反应增强，TNF-α作为重要的炎性因子，具有多种生物活性物质，如炎症反应及免疫反应，机体在正常状态时，TNF-α具有抗感染和加速组织修复的功能，但是机体处理病理状态时会促进组织损伤，TNF-α能够上调一氧化氮合酶的表达量，从而产生大量的一氧化氮，促进氧自由基生成，同时还能促进兴奋性氨基酸的释放，另外能破坏血脑屏障，加速炎性因子进入血液中，导致脑细胞损伤〔10〕。IL-1β是触发炎性反应的重要介质之一，能够通过促进白细胞和内皮细胞发生黏附而诱发炎症反应，而且还可以协同细胞因子激活淋巴细胞，另外能诱导其他炎性因子的释放，最终致使神经元损伤〔11〕。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族成员之一，主要分布在内皮细胞、淋巴细胞及中性粒细胞表面，机体处于正常状态时，ICAM-1表达水平低，但是血管内皮细胞出现损伤后，分泌大量的ICAM-1，其能够加速中性粒细胞和内皮细胞聚集，并释放氧自由基〔12〕。DEX作为这一种高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂，对α2受体的敏感性是α1的1 620倍，同时也是可乐定的8倍，半衰期比可乐定短，药代动力学的预测性强于可乐定，2009年我国食品药品监督管理总局批准应用于临床麻醉诱导、镇静及抗焦虑等，广泛应用于临床，但是并未对DEX的具体用量进行严格规定。本研究提示DEX能够有效改善脑缺血再灌注损伤大鼠血清及脑组织中的相关指标。DEX发挥药理作用主要有以下三个机制：①抑制中枢交感神经活性，提高脑部供血量和供氧量，改善脑部缺血区域血流灌注状态，抑制神经细胞凋亡，发挥神经保护的功能；②升高血管内Ca2+浓度，降低谷氨酸水平，避免神经中毒；③降低儿茶酚胺的释放量，降低炎症损伤程度，保护神经元。本研究结果提示不同剂量的DEX治疗脑缺血再灌注损伤并无显著的剂量关系，临床上可以选择较低的剂量进行治疗，从而降低药物不良反应。

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