液相色谱-串联质谱法测定饲料中金霉素、土霉素方法的探讨

周平 郑强 胡深 谈暠媛 王峻

摘要：探讨了利用QuEChFRS净化柱快速处理饲料样品，采用液相色谱-串联质谱仪准确测定猪浓缩饲料、精料补充料、预混合饲料等不同饲料样品中金霉素、土霉素含量的可行性，结果表明：该方法试验结果的相对平均偏差在2.09%～3.74%，回收率在71.5%～83.7%，说明该方法准确度高、重复性好，可用于饲料中金霉素、土霉素含量的测定。

关键词：液相色谱—串联质谱法;饲料;金霉素;土霉素;测定

中图分类号：S859.796;TQ465.4       文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2018）12-0007-02

金霉素、土霉素均为四环素类抗生素药，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，是一种高效广谱抗生素，普遍用于动物各种传染性疾病的治疗，是常用的生产和临床用抗生素药物，也具有良好的促进动物生长的作用，常应用于饲料添加，但长期使用会产生耐药性和药物残留[1]。为规范饲料中金霉素、土霉素的使用，2005、2008年我国分别颁布了饲料中金霉素、土霉素的高效液相色谱法测定标准[2，3]，部分地区也相继颁布了地方标准来规范金霉素、土霉素等抗生素的使用，同时也在逐步优化测定方法[4，5]。目前，金霉素、土霉素的检测方法主要有高效液相色谱法[2，3]、液相色谱-串联质谱测定法[4]、紫外分光光度法[6]等。本试验对液相色谱-串联质谱法测定饲料中金霉素、土霉素的含量进行了研究，旨在为生产实际中相关检测提供参考。

1  材料与方法

1.1  仪器设备

QTRAP4500液质联用仪（美国Sciex）;AE-200型電子天平; QuEChFRS净化柱;离心机。

1.2  试剂

试验用水为双重蒸馏水;金霉素、土霉素标准物质（纯度≥95%）：德国DR公司;甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯;柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、氨水为分析纯。

Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液（0.1 mol/L）：称取11.8 g柠檬酸-水合物，13.72 g磷酸氢二钠二水合物，33.62 g EDTA-2Na溶解于1 L水中，溶解摇匀后用氢氧化钠和盐酸调节pH至4.5。

甲酸水0.1%。

复溶液：甲酸水∶乙腈（90∶10，体积比）。

1 mg/ml的标准储备液：准确称取适量的金霉素、土霉素标准物质分别用甲醇配成1 mg/mL的标准储备液（-18 ℃保存）。

1.3  方法

1.3.1  样品前期处理  准确称取5 g样品于100 mL容量瓶中，加入60～70 mL Na2EDTA-Mcllvaine混匀，超声20 min，用Na2EDTA-Mcllvaine定容至100 mL备用。

取5 mL超声后的溶液于QuEChFRS净化柱中，混匀，5 000 r/min离心10 min，取中间层清液2 mL，40 ℃氮气吹干，加入1 mL复溶液复溶，过0.2 μm膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.2  最佳仪器条件的选择  对仪器进行调试和调整，确定最佳的仪器测定参数。

液相色谱条件：色谱柱，C18柱，150 mm×3.0 μm;粒径3.0 μm;柱温，33 ℃;进样量，20 μL。

质谱条件：离子源，电喷雾离子源;扫描方式，正离子扫描模式;检测方式，多反应监测;电喷雾电压、碰撞电压等条件优化至最佳。

1.3.3  液相色谱-串联质谱测定  用金霉素、土霉素基质混合标准工作溶液进样，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中金霉素、土霉素的响应值应在曲线范围内。

1.3.4  加标回收率试验  分别于空白样品中各加入5 μg的金霉素、土霉素标准使用液，利用“1.3.1”的前处理方式对样品进行处理，进行加标回收率的测定。

1.3.5  精密度试验

（1）平行性试验。将含有金霉素、土霉素的样品分别按照“1.3.1”的前处理方式对样品进行处理，每组3个平行，进行平行性试验。

（2）重现性试验。分别对样品进行连续3 d的测定，对此方法的稳定性进行检测。

2  结果与分析

2.1  线性范围和检出限结果

用标准储备液配制成0、10、20、50、100、200、500 ng/mL的浓度，以峰面积为纵坐标，标准工作溶液为横坐标绘制标准曲线，结果表明其线性关系较好（图1、图2、图3）。

2.2  样品加标回收率结果

由表1可见，样品加标回收率在71.5%～83.7%。表明该方法有较高的准确性。

2.3  精密度试验结果

由表2可见，3种样品本底测定值之间的相对平均偏差在2.09%～3.74%。由此可看出该种方法有较好的重复性。

对3种饲料进行连续3 d的试验结果见表3。由表3可见，其相对平均偏差在2.27%～3.23%，可看出该方法重现性良好，有较高的精密度。

3  结论

本试验利用QuEChFRS净化柱对猪的几种饲料进行处理，用液相色谱-串联质谱法测定饲料中金霉素、土霉素的含量，结果表明，该方法的重复性、平行性良好，精密度高、准确性好，回收率在71.5%～83.7%，试验前处理较为简单，便于大批量饲料样品中金霉素、土霉素含量的准确检测，可推广应用于饲料中金霉素、土霉素的监察测定等。

参考文献：

[1] 宋慧敏，耿士伟，冯三令，等.高效液相色谱法测定饲料中土霉素[J].中国农业科技导报，2008，10（S2）：43-47.

[2] GB/T 19684—2005饲料中金霉素的测定 高效液相色谱法[S].

[3] GB/T 22259—2008饲料中土霉素的测定 高效液相色谱法[S].

[4] DB13/T 1384.2—2011河北省地方标准 饲料中土霉素、四环素、金霉素的测定[S].

[5] 李北罡，王  义.高效液相色谱法研究饲料金霉素中金霉素和四环素含量的分别测定[J].内蒙古石油化工，1999，25（4）：48-50.

[6] 林红华，黄冬菊.用紫外分光光度法测定盐酸金霉素含量实验[J].福建畜牧兽医，2000，22（4）：24-26.