EGCG对肿瘤干细胞抑制效应研究进展

陈 磊，李开鸣，马会景，曾宪思，贾金婧，宋新强*

(信阳师范学院 a.生命科学学院；b.河南省茶树生物学重点实验室；c.图书馆，河南 信阳 464000)

0 引言

肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)是癌组织中普遍存在的一类特殊性细胞，在乳腺癌、肝癌、肺癌、神经胶质瘤、白血病等癌组织中均有发现，具有迁移侵袭性、自我更新、强耐药性和强致瘤性等特性，与癌症发生、转移灶形成、抗放(化)疗、癌症复发等直接相关，是癌症治疗的热点和难点[1]．研究发现，CSCs也是导致癌症遗传异质性的主要原因之一[2]．CSCs在自我更新过程中持续发生基因突变并在子代细胞中积累，形成异质性细胞群并演化成遗传异质性癌组织，为临床癌症分型和治疗增添障碍[3]．越来越多的研究者认为，寻找靶向CSCs的特异性药物是癌症研究和临床治疗的关键．

表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶的主要活性成分之一，占儿茶素类化合物的50%～60%，具有清除自由基、降低氧化损伤等作用，对正常的组织和细胞没有毒性，但是对癌症的预防和治疗有积极效应[4]．研究表明，EGCG通过调节Wnt/β-catenin、AKT等信号通路传递途径抑制CSCs，增强一线化疗药物的抗癌作用，为临床癌症治疗提供一种新的化疗方案[5]．鉴于此，本文对EGCG作用于CSCs迁移侵袭性、自我更新、抗药性和致瘤性等特性的相关研究进行了综述．

1 EGCG对CSCs迁移侵袭性的抑制效应

迁徙肿瘤干细胞(Migrating cancer stem cells，MCSs)是CSCs的重要亚群之一，能够从原发灶中脱落并通过血液和淋巴系统向器官转移，在合适的微环境下定植形成转移灶[6]．在迁移初期，MCSs过表达迁移侵袭性关键因子获得能动性，上调基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)表达水平,降解细胞外基质，解脱细胞外基质对细胞的束缚，癌细胞发生迁移和侵袭．在针对不同癌细胞研究中发现，EGCG对迁移侵袭性关键基因和MMPs的过表达具备抑制效应[7]．

1.1 EGCG对MMPs过表达的抑制效应

EGCG对MMPs的抑制效应有两条途径，一条是直接抑制MMPs表达量和活性水平，另一条是增强MMPs抑制分子表达量，参与的信号传导途径包括AKT、ERK和NF-κB等通路．在乳腺癌细胞中，EGCG下调HGF表达量，降低Met磷酸化水平并引起AKT和ERK信号通路衰减，阻抑FAK和 ERK结合到MMP-9启动子区，下调MMP-9表达量和活性水平，抑制癌细胞迁移和侵袭[8]．Park等人[9]在研究唾液腺癌细胞的过程中发现，EGCG通过剂量依赖性下调β1 integrin的表达水平，抑制异常活跃的FAK、AKT和ERK信号传递途径，降低MMP-2和MMP-9表达水平．Luo等人[10]也发现，EGCG通过抑制膀胱癌细胞NF-κB表达水平和磷酸化水平而抑制MMP-9过表达，将NF-κB基因沉默后EGCG则无法发挥这种抑制效应．此外，在口腔癌、结肠癌和前列腺癌细胞的研究中，ERK1/2和NF-κB信号通路主要参与EGCG对MMP-2和MMP-9过表达的抑制效应[11]．上调MMPs抑制因子表达是EGCG作用于MMPs另一条途径．在乳腺癌的研究中发现，EGCG通过下调EZH2表达量和活性水平，增强抑制因子TIMP-1和-3的表达量和活性水平，抑制MMP-2和MMP-3过表达[12]．相对于之前细胞系的研究，ZHANG等人[13]的临床研究结果更具有说服力．他们给放疗病人每天3次服用剂量为400 mg的 EGCG胶囊，然后对其血管中癌细胞MMP-9和MMP-2活性水平进行检测后发现，MMP-9和MMP-2活性明显下调，细胞迁移特性显著降低．以上研究结果表明，EGCG具备抑制MMPs过表达而降低癌细胞迁移侵袭性的效应．

EGCG对MMPs的抑制效应有两条途径，一条是直接抑制MMPs表达量和活性水平，另一条是增强MMPs抑制分子表达量，参与的信号传导途径包括AKT、ERK和NF-κB等通路．在乳腺癌细胞中，EGCG下调HGF表达量，降低Met磷酸化水平并引起AKT和ERK信号通路衰减，阻抑FAK和 ERK结合到MMP-9启动子区，下调MMP-9表达量和活性水平，抑制癌细胞迁移和侵袭[8]．Park等人[9]在研究唾液腺癌细胞的过程中发现，EGCG通过剂量依赖性下调β1 integrin的表达水平，抑制异常活跃的FAK、AKT和ERK信号传递途径，降低MMP-2和MMP-9表达水平．Luo等人[10]也发现，EGCG通过抑制膀胱癌细胞NF-κB表达水平和磷酸化水平而抑制MMP-9过表达，将NF-κB基因沉默后EGCG则无法发挥这种抑制效应．此外，在口腔癌、结肠癌和前列腺癌细胞的研究中，ERK1/2和NF-κB信号通路主要参与EGCG对MMP-2和MMP-9过表达的抑制效应[11]．上调MMPs抑制因子表达是EGCG作用于MMPs另一条途径．在乳腺癌的研究中发现，EGCG通过下调EZH2表达量和活性水平，增强抑制因子TIMP-1和-3的表达量和活性水平，抑制MMP-2和MMP-3过表达[12]．相对于之前细胞系的研究，ZHANG等人[13]的临床研究结果更具有说服力．他们给放疗病人每天3次服用剂量为400 mg的 EGCG胶囊，然后对其血管中癌细胞MMP-9和MMP-2活性水平进行检测后发现，MMP-9和MMP-2活性明显下调，细胞迁移特性显著降低．以上研究结果表明，EGCG具备抑制MMPs过表达而降低癌细胞迁移侵袭性的效应．

1.2 EGCG对迁移侵袭性标志基因的影响

迁移侵袭性标志基因过表达是CSCs迁移的主要原因，而EGCG能抑制这些标记基因的过表达．在对甲状腺癌、肺癌的研究中发现，EGCG直接作用于ERK1/2信号通路来抑制癌细胞的迁移[14]．EGCG通过衰减ERK1/2磷酸化水平而抑制Smad2表达量和磷酸化水平，抑制上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)关键因子ZEB1、Snail、Slug、Twist和vimentin表达量，增强黏附蛋白E-cadherin表达水平，抑制细胞的迁移侵袭性．在膀胱癌、乳腺癌中，AKT信号通路主要参与EGCG的抑制效应[15]．例如在乳腺癌细胞中，EGCG促进癌细胞过表达AKT信号通路抑制分子FOXO3α，抑制EMT转录因子Snail表达，促进黏着蛋白E-cadherin而抑制癌细胞迁移．NF-κB/p65信号通路则主要参与了EGCG对鼻咽癌和黑色素瘤的抑制效应[16]．EGCG通过干扰p65细胞膜定位而抑制NF-κB活性，下调COX-2、PGE2R等关键蛋白表达水平，下调EMT标志蛋白Twist1、vimentin、N-cadherin表达量，抑制细胞发生EMT．此外，在三维培养体系下研究发现，EGCG抑制支气管癌、鼻咽癌和口腔鳞癌过表达迁移关键蛋白vimentin、Snail等，抑制癌细胞的迁移侵袭性[17]．

2 EGCG对CSCs自我更新的抑制效应

自我更新是CSCs主要特性之一，与癌症发生和转移灶形成直接相关[18]．自我更新能维持癌组织中存在一定数量的CSCs，又能形成具备持续分裂能力的癌细胞．在自我更新过程中，癌细胞通过积累突变而发生基因组演化，形成遗传异质性癌组织，给临床癌症分型和治疗带来极大的困难[19]．Wnt/β-catenin、mTOR、Hedgehog等干细胞相关信号通路的异常激活是CSCs维持自我更新特性的主要原因，研发针对这些信号通路的药物是治疗CSCs的关键[20]

2.1 对Wnt/β-catenin信号通路的影响

Wnt/β-catenin信号通路是CSCs调节自我更新的关键途径，该通路过度激活引起β-catenin积累并持续向核内运输，与TCF/Lef形成复合物而激活基因c-myc、Cyclin D1、CD44等表达，诱导癌细胞获得自我更新[20]．研究发现，EGCG能降低β-catenin与Wnt蛋白的表达量和活性水平，弱化Wnt/β-catenin信号传导通路．直接抑制β-catenin表达是EGCG作用于Wnt/β-catenin信号通路的作用之一．EGCG不依赖GSK-3β和PP2A途径诱导β-catenin N末端Ser33/37残基的磷酸化而促进β-catenin降解，降低细胞内β-catenin浓度[21]，并抑制β-catenin向细胞核内运输，阻碍β-catenin/TCF/Lef复合体的形成，从而衰减Wnt/β-catenin信号通路，下调干细胞标志物ALDH1A1、Nanog、Oct4、CD133等表达，抑制CSCs自我更新[22]．ZHU等人[23]在对肺癌CSCs的研究中也发现，LiCl具备上调β-catenin表达量并促进CSCs标志物ALDH1A1、Nanog、Oct4、CD133等表达的作用，能有效逆转EGCG的抑制效应，进一步证实EGCG是通过Wnt/β-catenin信号通路来抑制肺癌CSCs自我更新．抑制Wnt蛋白表达水平是EGCG弱化Wnt/β-catenin信号通路的另一途径．KIM等人[24]在乳腺癌的研究中发现，EGCG通过调控mRNA稳定性而增强Wnt蛋白抑制分子BMP1蛋白表达量，抑制Wnt/β-catenin信号通路，下调Wnt和C-Myc等干细胞标志蛋白表达量．GODEKE研究小组[25]也报道了EGCG诱导肝癌CSCs抑制分子SFRP1表达，直接降低细胞中Wnt蛋白含量，弱化Wnt/β-catenin信号通路的传递，抑制癌细胞克隆形成．相对于之前的研究，CHEN等[26]利用全基因分析技术对舌鳞癌细胞分析发现，EGCG通过引起Wnt基因甲基化而发挥抑制Wnt表达的效应．

2.2 对Hedgehog信号通路的影响

Hedgehog信号通路是CSCs中另一种异常活化的信号传递途径，与CSCs自我更新、抗药性等直接相关．Hedgehog信号通路以Hedgehog-Ptch-SMO-Gli为信号传导途径，EGCG能干扰这一传导途径．TANG等人[27]的研究发现，用EGCG处理后的胰腺癌CSCs，Hedgehog信号通路关键信号分子Smo、Ptch-1和Ptch-2表达量明显下降，通路下游关键效应物Gli1和Gli2的表达水平也下调，CSCs标志分子Nanog、c-Myc和Oct-4的表达水平也显著降低，细胞单克隆形成能力明显减弱．随后SUR等人[28]利用小鼠体内成瘤模型研究发现，EGCG抑制肝癌细胞过表达Smo和Ptch-1蛋白，降低干细胞样细胞(CD44阳性)数量，进一步证实EGCG在体内仍然具备抑制Hedgehog信号通路的作用．在小鼠舌癌模型的研究中同样也发现，EGCG通过抑制Smo和Ptch-1的表达而减弱Hedgehog信号通路，降低效应基因c-Myc、Cyclin D1、EGFR等表达，抑制细胞单克隆形成能力，减少癌组织中CSCs的数量[29]．体外和体内实验同时证实，EGCG通过对Hedgehog信号通路传递具备抑制效应．

2.3 对其他信号通路的影响

mTOR和Notch信号通路也是CSCs自我更新的关键细胞通路，是靶向治疗CSCs的热点[30]．EGCG对这两种信号通路也具备抑制效应[31]．EGCG能下调ER-α和EGFR信号分子的表达量[32]，弱化Stat3信号分子的活性水平，弱化mTOR信号通路，从而下调CSCs自我更新关键基因Oct-4、Nanog等表达量，抑制癌细胞克隆形成能力[33]．WUBETU等人[34]用EGCG处理结肠癌和肝癌CSCs后也发现，EGCG通过下调Nek2表达量而降低AKT磷酸化水平，衰减mTOR信号通路，降低CSCs标志蛋白CD133、Nanog等表达量，抑制CSCs自我更新特性．LEE等人[35]对头颈鳞癌CSCs的研究中发现，EGCG通过抑制Notch信号分子的表达水平而下调CSCs标记物Oct4、Sox2和Nanog等表达量，抑制癌细胞单克隆形成能力．

3 EGCG对CSCs致瘤性的影响

致瘤性是CSCs的关键特征，与原发灶和转移灶形成直接相关，研发针对CSCs致瘤性的特异性药物是靶向治疗CSCs的关键．前期研究发现，EGCG对乳腺癌和前列腺癌细胞的致瘤性具备抑制效应[36]．EGCG直接诱导乳腺癌CSCs发生凋亡而抑制肿瘤形成．LEE等人[35]在头颈鳞癌CSCs的研究中也发现，EGCG通过抑制自我更新而弱化CSCs致瘤性．SUR等人[28]的研究中进一步发现，Wnt 和Hedgehog信号传导途径参与EGCG针对肝癌CSCs致瘤性的抑制效应．EGCG降低Wnt信号通路中关键分子β-catenin的表达和磷酸化水平，抑制Hedgehog信号通路效应分子Gli1和SMO的表达量，同时弱化Wnt 和Hedgehog信号传导途径，降低CSCs(CD44阳性)的含量而抑制肿瘤发生．相对于之前的研究，YU等人[37]还发现，miR-204是EGCG抑制口腔鳞癌CSCs致瘤性的另一途径．miR-204具备特异结合到干细胞标记基因Slug和Sox4的3′端UTR区而抑制基因表达的功能，在口腔鳞癌CSCs中低水平表达．EGCG能促进癌细胞表达miR-204，抑制口腔鳞癌CSCs(ALDH1和CD44阳性)的含量、自我更新和致瘤性．

4 EGCG对CSCs强耐药性的影响

CSCs对化疗药物和抗癌分子具有极强的耐药性，在对癌症患者化疗时，普通癌细胞被杀死而CSCs则存活下来，甚至部分静息的CSCs被激活，重新形成癌症并发生转移[38]．CSCs耐药性的主要原因，一方面是CSCs小生境引起的，例如低氧、低pH值、免疫反应等，激活CSCs抗药性信号通路；另一方面是由于细胞过表达标志性蛋白引发的，例如ABCG1、ABCG2等细胞膜转运蛋白，具备将药物及时排到胞外而降低药物对细胞的杀伤性[39]．研究发现，EGCG能降低或逆转癌细胞的耐药性，减少化疗药物的使用浓度并增强杀抗癌效果[40-42]．在针对CSCs定向治疗的研究发现，EGCG同样对CSCs耐药性也有积极作用．

4.1 对化疗药物作用于CSCs的影响

EGCG弱化CSCs抗药性的作用途径主要有3种：膜蛋白、自我更新途径和miRNAs．首先，EGCG特异抑制CSCs膜上转运蛋白(例如ABCC2 和ABCG2等)活性和表达量，降低药物被泵出细胞的量而提高CSCs内药物浓度，增强抗癌药物对CSCs杀伤性，在头颈癌、胆道癌和鼻咽癌等CSCs中均有发现[33, 35,43]．例如，鼻咽癌CSCs过表达转运蛋白ABCG2等，而 EGCG通过弱化Stat3信号通路下调ABCG2表达量，增强化疗药物顺铂对CSCs的杀伤性．其次，EGCG直接作用于CSCs自我更新和致瘤性相关信号通路的传递途径，降低CSCs耐药性[41]．例如在神经胶质瘤CSCs中，EGCG下调P-糖蛋白的磷酸化水平而抑制癌细胞自我更新，提高CSCs的药物敏感性，增强替莫唑胺对细胞的杀伤能力[44]．此外，TODEN等人[45]在对结肠癌CSCs的研究中发现，EGCG通过上调miR-34a、miR-145和miR-200c等转录水平来抑制Notch1、Bmi1、Suz12和Ezh2等基因表达，提高CSCs对5-氟尿嘧啶敏感性．

4.2 对抗癌分子治疗CSCs的影响

一些小分子具有很弱的抗癌性，但是联合EGCG后却能够发挥出较强的抑制CSCs的效果[46]．CHUNG等人[47]对乳腺癌CSCs的研究中发现，联合EGCG和姜黄素能有效降低Stat3磷酸化水平而阻滞Stat3-NFκB信号通路，降低干细胞含量，抑制细胞迁移性和自我更新．PLUCHINO等人[48]将无抗癌浓度的EGCG(10 μg/mL)和ECG(10 μg/mL)联合应用处理乳腺癌细胞，结果发现癌细胞下调Ras和Nox-1表达，下调ERK1/2磷酸化水平并引起Ras-ERK-Nox信号传递途径的衰减，下调EMT和CSCs标记物表达量，降低CSCs(ALDH阳性)在细胞群中的含量．槲皮素是另外一种与EGCG联合应用具有抑制CSCs特性的活性分子．TANG等人[49]在前列腺癌CSCs的研究中发现，EGCG联合槲皮素能有效抑制CSCs的迁移侵袭性和克隆形成能力，并诱导CSCs发生凋亡．在随后的研究中进一步发现，槲皮素联合EGCG能引起胰腺癌CSCs中Hedgehog信号通路衰减，下调干细胞标记物Nanog、c-Myc和Oct-4的表达，降低CSCs在细胞群中的含量[27]．随后WANG等人[50]的研究还发现，EGCG联合槲皮素能降低Stat3和AKT磷酸化水平而弱化PI3K/AKT信号通路，下调抗药性蛋白MRP1的表达量，抑制细胞的侵袭性和单克隆形成能力，降低干细胞样细胞(CD44+/CD24+)含量，并能有效减缓多西紫杉醇的副作用．

5 应用新策略

在体液中，EGCG易发生氧化还原反应而失去抗癌活性，不利于临床应用[51]．将EGCG改性或者利用特殊运输方法，能有效解决EGCG活性不稳定的问题．NARAYANAN的课题小组[52]利用PLGA-Casein纳米微球技术，建立EGCG-紫杉醇药物缓释体系，能延长药物释放时间，有效弱化NF-κB信号通路传导途径而抑制癌细胞侵袭性．CHIOU等人[53]将EGCG改性成乙酰-EGCG(AcEGCG)增强稳定性，更有效抑制皮肤癌CSCs合成蛋白激酶D1(Protein kinase D1，PKD1)，下调c-Jun、PI3K和AKT的磷酸化水平并弱化PI3K/AKT信号通路，抑制CSCs标记物c-Myc表达量和癌细胞致瘤性．CHEN等人[54]通过化学合成的方法制备EGCG类似物，能有效活化AMPK信号通路并上调细胞抑制因子p21表达量，减弱mTOR信号通路的传递，减少乳腺癌CSCs含量．将EGCG和放射性纳米金-198偶联成复合物，能特异识别前列腺癌细胞膜表面受体Laminin 67R，提高癌细胞表面EGCG-Au198浓度，增强对CSCs抑制效果．通过这些应用新策略，EGCG抑制CSCs活性得到有效增强，为临床应用提供新途径．

6 展望

EGCG是绿茶的主要活性成分，具备抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡的药理学作用，对癌症的治疗和预防具备积极作用．肿瘤干细胞学说的提出，更科学地解释了EGCG作用于肿瘤发生、发展和转移灶形成的机理．EGCG通过弱化Wnt/β-catenin、mTOR、Hedgehog、Notch和AKT信号通路等CSCs关键信号传递途径，抑制CSCs侵袭性、自我更新、耐药性和致瘤性等特性，降低干细胞样细胞含量并特异诱导CSCs发生凋亡．然而，ECGC应用于临床抗癌还存在着很多问题．首先，这些研究大多是基于2D培养技术，2D培养的CSCs易于分化而失去干细胞特性，细胞与EGCG充分接触而提高CSCs的药物敏感性，不能如实反映出EGCG在体内真实的抑制CSCs活性．其次，溶解在磷酸缓冲液中的EGCG易于被氧化，口服EGCG人体吸收率较低，人体吸收后的EGCG易于被体内儿茶酚-O-甲酰转移酶甲基化.这些原因导致EGCG在体内活性水平较低，无法有效发挥抗癌作用．EGCG改性、纳米载体技术等新应用技术虽然能部分克服这些问题，但是这些技术还只是出于实验室研究阶段，缺少药理毒理学研究，临床数据更是不足．因此，未来的研究方向一方面是利用新的研究模型研究EGCG对CSCs药理学作用，并探索EGCG联合一线化疗药物治疗CSCs的可行性，结合临床数据充分验证说明；另一方面要注重新型应用技术(例如纳米载体)的药理毒理学研究，为EGCG应用于临床治疗肿瘤提供更为严谨的实验数据.