口蹄疫病毒基因组3' 末端序列扩增及分析

李金娜，苗书魁，马文戈，魏玉荣，汪 萍，夏 俊，陆桂丽，米晓云，沙依兰·卡依扎，王 延，魏 婕，黄 炯

(1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)，乌鲁木齐 830011)

0 引 言

【研究意义】口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMDV引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触感染的传染病[1]。口蹄疫病毒型多易变，宿主谱广，传播途径多，自然康复动物长期排毒，同群动物发病即扑杀处置，导致经济损失巨大、政治影响严重。因此，OIE将其规定为法定报告的传染病，我国将其列为一类动物传染病[2]。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，基因组为单股正链RNA，RNA分子位于衣壳内，约有8 500个核苷酸(nucleotide，nt)。基因组5'端共价连接着一个病毒编码的小蛋白质(VPg)，紧接着依次由5'非翻译区(Untranslated region，UTR)、开放阅读框(Open reading fragment，ORF)、3'UTR和Poly(A)组成。试验用普通PCR法和3'RACE法扩增3'端序列，对FMDV反向遗传学研究有实际意义。【前人研究进展】FMDV全基因组序列的扩增已有很多报道，其中选用最多的扩增方法为普通PCR方法[3-10]，这些学者先提取FMDV的RNA，反转录后获得cDNA，再以cDNA为模板，利用设计的多对引物分别进行普通PCR，将扩增产物测序，最后拼接得到病毒全基因组序列。Arzt J等[11]将FMDV全基因组设计为5'UTR、ORF和3'UTR三个相互重叠的片段，提取病毒RNA后，采用RT-PCR获得了FMDV全基因组序列。【本研究切入点】有关FMDV同一毒株不同亚克隆之间Poly(A)长度的研究尚未见报道。研究口蹄疫病毒基因组3'末端序列扩增。【拟解决的关键问题】试验采用普通PCR法和3'RACE法对FMDV基因组3'末端进行扩增，对3'UTR序列进行分析，比较Poly(A)长度的不同，为FMDV 3'端序列的扩增、FMDV结构与功能的研究、基因组结构、感染性克隆构建、致病机理和毒力变异机制等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒基因组RNA和细胞

口蹄疫病毒O/Akesu/58 CE39A是1958年采集自新疆阿克苏地区的牦牛口蹄疫O型病毒，经过鸡胚适应传代39代次驯化致弱，再筛选获得的克隆毒株A。基因组RNA自1990年代由新疆畜牧科学院兽医研究所保存于液氮中。BHK-21细胞由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。感受态大肠埃希菌DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要试剂

反转录试剂Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Cat.Not.04896866001)购自Roche公司，PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司。

1.1.3 引物设计与合成

根据GenBank中O型口蹄疫参考序列(GenBank登录号：EF552696)，在病毒全基因组3'端设计1对引物及3'RACE引物，由新疆昆泰锐生物技术有限公司合成。表1

表1 3'端序列扩增引物
Table 1 Primers for amplification of the 3'-end sequences

引物Primer位置Position序列Sequence(5'→3')Poly(A)长度The length of Poly(A)1F7 987TCTGGACCTGACGAGTACCG1R3'末端TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT23/24/25/27/29/43Gene Specific Outer Primer7 614TCTACGTGCTCTACGCCTTGGene Specific Inner Primer7 642CTATGAGGGGGTTGAGCTGGAC19

1.2 方 法

1.2.1 RNA纯度测定

取液氮中保存的FMDV O/Akesu/58 CE39A RNA 10 μL，加990 μL ddH2O,混匀，于紫外分光光度计测定其核酸纯度。

1.2.2 反转录

将保存的口蹄疫病毒O/Akesu/58 CE39A RNA反转录为cDNA，操作过程按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明书操作，反转录引物选用Oligo (dT)18。

1.2.3 3'末端序列扩增

以反转录产物cDNA为模板，以普通PCR(引物1F/1R)和3'RACE法分别对O/Akesu/58 CE39A毒株全基因组3'端序列进行扩增。所用引物见表1。

普通PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃ 30 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s进行25个循环；最后72℃延伸10 min。

3'RACE法Outer PCR反应条件：94℃预变性3 min；再以94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s进行25个循环；最后72℃延伸10 min。

3'RACE法Inner PCR反应条件：94℃预变性3 min；再以94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s进行25个循环；最后72℃延伸10 min。

各取5 μL PCR产物，以1%琼脂糖凝胶进行电泳。

1.2.4 目的片段的克隆与鉴定

将普通PCR产物克隆至pMD19-T载体(标记为：pMD19-T-1)，将3'RACE法Inner PCR产物克隆至pMD19-T载体(标记为：pMD19-T-3)，分别转化DH5α，挑单菌落培养，提取质粒。将质粒pMD19-T-1和pMD19-T-3均用Xba I和Sal I双酶切鉴定，各选7个阳性质粒送新疆昆泰锐生物技术有限公司测序。

1.2.5 3'UTR序列分析

用DNAStar、DNAMAN等软件对病毒全基因组3'UTR序列进行分析，并与参考毒株的序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 RNA纯度测定

以分光光度计测得O/Akesu/58 CE39A株基因组RNA A260/A280为1.871，此RNA中可能有部分蛋白质或其它有机物的污染，或是完整RNA降解导致纯度降低，但在允许范围1.8～2.0之内。

2.2 3'端序列扩增

普通PCR法扩增出了目的条带，3'RACE法也扩增出了目的条带。图1

注：M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1，普通PCR法扩增的目的条带(237 bp)；3，3'RACE法扩增的目的条带(597 bp)

Note: M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1，The target bands amplified by general PCR(237 bp)；3，The target bands amplified by 3'RACE(597 bp)

图1 3' 端序列扩增
Fig.1 Amplification of 3'-end sequences

2.3 重组质粒的酶切鉴定

将质粒pMD19-T-1和pMD19-T-3均用Xba I和Sal I双酶切后，以1%琼脂糖凝胶电泳分析，均得到预期大小的两条带。质粒pMD19-T-1的两条带为：2 680 bp(pMD19-T载体)+249 bp(片段)(图2，1)，质粒pMD19-T-3的两条带为：2 680 bp(pMD19-T载体)+641 bp(片段)(图2，3)，说明得到的2个质粒均为阳性质粒。图2

2.4 3'UTR序列

用3'RACE法扩增的3'端序列大小为565 bp，包括部分非结构蛋白(3D)基因以及紧接着3D基因下游的3'UTR和Poly(A)尾，3'UTR长度为98 nt，Poly(A)长度为19 nt。3'UTR序列从终止密码子UAA到3'端Poly(A)有98 nt(8 101～8 198 nt)。用DNAMAN软件分析3'UTR序列，显示其二级结构含有2个茎环结构，分别位于8 101～8 140和8 146～8 190 nt。

用DNAStar、DNAMAN等软件对O/Akesu/58 CE39A株3'UTR序列与参考毒株的3'UTR序列进行比对。研究表明，O/Akesu/58 CE39A株与参考毒株O/MAY/3/2014(GenBank登录号：KY322672)和O/IND26(54)/2014(GenBank登录号：KJ825807)的核苷酸序列同源性最高，均为89.8%。

注：M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：pMD19-T-1酶切产物(2 680 bp+249 bp)；3：pMD19-T-3酶切产物(2 680 bp+641 bp)

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The products from pMD19-T-1 (2 680 bp+249 bp); 3: The products from pMD19-T-3 (2 680 bp+641 bp)

图2 重组质粒酶切鉴定
Fig.2 Restriction endonuclease digestion identification of recombinant plasmid

2.5 Poly(A)长度

以普通PCR扩增，将得到的多个亚克隆测序，其Poly(A)数量为23、24、25、27、29、43；以3'RACE法扩增，测得亚克隆的Poly(A)数量为19，说明不同扩增方法获得的亚克隆之间Poly(A)长度存在差异。普通PCR和3'RACE法扩增后测得Poly(A)数量差异的可能原因是，3'RACE法扩增时，试剂盒引物中Poly(T)数量可能为19，扩增后Poly(A)数量为19。而普通PCR的6个亚克隆测得Poly(A)数量不同，可能原因为，第一，RNA质量的影响。FMDV RNA为单链结构，容易断裂，所提取的RNA中有断裂的RNA，反转录后cDNA中Poly(A) 长度不同；第二，FMDV RNA长约8 500 nt，基因组长，末端结构复杂，反转录时，反转录引物与模板配对的位置不同，则反转录产物中Poly(A)长度不同。第三，上述2个原因导致反转录产物为全长cDNA和非全长cDNA的混合物，即模板为含不同长度Poly(A)的大量cDNA混合物。进行PCR时，即使模板中Poly(A) 长度相同，但由于下游引物与模板配对是随机的，下游引物与模板结合的位置不同，则扩增的片段中Poly(A)的长度有所不同。况且模板为含不同长度Poly(A)的cDNA混合物，扩增后片段中Poly(A)的长度肯定不同。图3

图3 不同长度的Poly(A)
Fig.3 The different lengths of the Poly(A)

3 讨 论

FMDV 3'UTR和Poly(A)在病毒复制中起着至关重要的作用，其特性和作用并不是很明确。Poly(A)与3'UTR共价相连，可能是病毒有效复制或翻译所必需的结构[13]。Poly (A)与病毒毒力有关，Poly (A)长度与病毒毒力的具体关系尚未定论。为了确定3'UTR和Poly(A) 的作用，需要先对这段序列进行扩增。因此，对3'端序列的扩增显得尤为重要。但FMDV基因组3'端结构复杂，难于扩增。计算机分析发现FMDV China/99的3'端为一个类似三叶草的二级结构[14]，研究显示O/Akesu/58 CE39A株的3'UTR含有2个茎环结构，与有的学者[15-16]报道的一致。3'UTR的一部分位于非结构蛋白3D编码区之后，长约100 nt，能形成特殊的高级结构[17]，小RNA病毒基因组包括一个Poly (A)区段，该区段可以折叠成特殊结构[18]。上述特殊结构均增加了3'端序列扩增的难度，尤其是Poly(A)的扩增。试验采用普通PCR法和3'RACE法均扩增出了FMDV 3'端序列，为3'UTR和Poly(A)作用的研究奠定了基础。

研究发现FMDV Poly(A) 的长度不同。Chatterjee N K等[19]认为FMDV基因组3'末端Poly(A)尾长达60～80 nt。刘光清等[12]采用3'RACE法克隆得到的Poly(A)长度为56 nt。试验测得Poly(A)数量为19、23、24、25、27、29、43，说明同一毒株的亚克隆，其Poly(A) 长度与基因扩增时所用方法有关。通常Poly(A)要么扩增成功后其长度不同，要么扩增失败，失败的原因可能是3'末端结构复杂。将GenBank中部分FMDV的序列进行比对，发现有的序列具有Poly(A)[如(登录号：AB079061)、(登录号：AF308157)、(登录号：AJ633821)、(登录号：EF552696) 、(登录号：AY593811)和(登录号：HM008917)等]，而有的序列没有Poly(A)[如(登录号：AJ539138)、(登录号：AJ539140)、(登录号：AY312589)、(登录号：AH012984) 、(登录号： KJ825804)和(登录号： KJ825802)]。没有Poly(A)的原因可能是研究者与笔者扩增的结果类似，不同亚克隆获得的Poly(A)长度有差异，由于没有确切的长度故而登录时省略；也有可能是试验中未扩增出来，若如此，则要采用不同方法进行多次扩增，以得到Poly(A)。

目前，对Poly(A)尾功能的报道较少，且说法不一，其具体功能仍处于探索阶段。Poly(A)尾在基因组复制方面起着重要作用。Poly (A)的存在能使FMDV转录及时有效地终止[20]。Poly(A)不但具有稳定病毒基因组结构的功能，而且对维持其感染性也有一定的作用[21]。Poly(A)的长度与感染性的关系一直存在争议。认为Poly(A)的长度越长越好，也有人认为O型FMDV Poly (A)的长度与病毒感染性之间的关系很小或没有相关性[21-22]；与此相反，C型Poly (A)序列10 nt与40 nt之间的感染性差异在5～16倍，与PV、EMCV、SV等病毒相似[11，21]。苗书魁等[23]认为Poly(A)长度与感染性的关系不是确定的，不是越长越好，或越短越好，而是依毒株而定。因此，通过对FMDV 3'端序列的扩增，为3'UTR和Poly (A)长度的研究，为病毒复制、FMDV结构与功能的研究、Poly(A)长度与感染性关系、感染性克隆构建、致病机理和毒力变异机制等提供参考。

4 结 论

4.1 普通PCR法和3'RACE法均可扩增出FMDV基因组3'末端序列。用3'RACE法扩增的3'端序列大小为565 bp，包括部分非结构蛋白(3D)基因以及紧接着3D基因下游的3'UTR和Poly( A)尾，3'UTR长度为98 nt(8 101～8 198 nt)，Poly(A)长度为19 nt。用DNAMAN软件分析3'UTR序列，显示其二级结构含有2个茎环结构，分别位于8 101～8 140和8 146～8 190 nt。

4.2 测得FMDV Poly(A)数量为19、23、24、25、27、29、43，说明同一毒株的亚克隆，其Poly(A) 长度与基因扩增时所用方法有关。据此推测，不同毒株的Poly(A)长度不同，可能是毒株本身属性，也有可能是由扩增方法不同造成。

4.3 Poly(A)要么扩增成功后其长度不同，要么扩增失败，失败的原因可能是3'末端结构复杂，难于扩增。

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