流式细胞仪快速定量检测牛奶中沙门氏菌

王琪然

【摘 要】 本研究采用沙门氏菌多克隆抗体特异性标记沙门氏菌，并辅以膜选择通透性荧光染料碘化丙啶（PI）来标记区分死菌和活菌，采用流式细胞仪进行定量检测分析。实验结果表明：流式细胞仪法方法的灵敏度为1.83 × 103 CFU/mL，与平板培养计数法相比，两种方法的检测结果具有很高的一致性，检测时间由原先的3 d～5 d缩短至35 min。综上所述，流式细胞仪法能快速、定量地检测出牛奶样品中的沙门氏菌，在食源性致病菌的快速筛查和监控中具有重要的应用价值。

【关键词】 流式细胞仪；沙门氏菌活菌；快速检测；牛奶

【中图分类号】R197.3 【文献标志码】B 【文章编号】1005-0019（2018）24-245-01

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型（ATCC13311）、肠沙门氏菌肠亚种婴儿血清型（CICC21482）、大肠杆菌（ATCC10798）、霍乱弧菌（CICC23794）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、副溶血弧菌（ATCC17802）、单增李斯特氏菌（ATCC19111）均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

牛奶中微生物快速纯化试剂盒购于北京亦泰生物技术有限公司，偶联有异硫氰酸荧光素（FITC）的沙门氏菌多克隆抗体购于美国Kirkegaard Perry Laboratories公司，核酸荧光染料碘化丙啶（PI）购于美国Thermo Fisher Scientific公司。全脂灭菌乳购于北京三元食品股份有限公司。

1.2 仪器与设备

A50-Micro型流式细胞仪 英国Apogee公司；恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；HZQ-X100型恒温振荡培养箱 江苏太仓市实验设备厂；1-14型离心机 美国Spectronics公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌悬浊液的制备

将本文1.1中所述的7种菌株分别接种于营养肉汤培养基中，在恒温震荡培养箱内37℃培养12 h。取菌液，12000 × g离心10 min，弃去上清液，底部沉淀用磷酸盐缓冲溶液（PBS）重悬。用灭菌的PBS将重悬后的肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型（沙门氏菌ATCC 13311）纯菌液进行10倍系列稀释。

1.3.2 沙门氏菌的染色

将沙门氏菌ATCC 13311采用绿色荧光染料FITC标记的抗体进行特异性标记，再采用红色荧光材料PI标记区分死菌与活菌，通过流式细胞仪的荧光通道进行检测。。

1.3.3 流式检测方法的特异性

将本研究1.1中的7种菌株制备成107 CFU/mL菌悬液，再将菌悬液分别与FITC标记的沙门氏菌多克隆抗体在37℃下孵育15 min，用流式细胞仪验证其特异性。

1.3.4 流式检测方法的线性与灵敏度

将沙门氏菌ATCC 13311用PBS溶液进行10倍系列稀释，再分别采用国标中菌落总数测定的平板培养计数法和流式检测法进行定量检测，验证流式检测法的线性与灵敏度。

1.3.5 人工污染灭菌乳样品的检测

将沙门氏菌ATCC 13311接种到煮沸处理过的灭菌乳中，制备成人工污染的乳样品，浓度为2.00 × 103～2.00 × 108 CFU/mL。按照牛奶中微生物快速纯化试剂盒纯化沙门氏菌说明书操作，去除灭菌乳中的蛋白颗粒和脂肪，得到纯化的样品溶液，经双染色后，用流式细胞仪进行检测。

2 结果与分析

2.1 流式检测方法的线性与灵敏度

采用流式细胞仪法和平板培养计数法同时对10倍系列稀释的沙门氏菌进行检测。将菌液浓度在103～108 CFU/mL的检测结果绘制出标准曲线，如图1所示，流式检测法与平板计数法线性良好（R2=0.9988），检测范围为2.27 × 103～3.49 × 108 CFU/mL，灵敏度为2.27 × 103 CFU/mL 。

2.2 流式细胞仪检测方法的特异性

将本研究1.1中的7种菌株分别与沙门氏菌多克隆抗体在进行反应，只有沙门氏菌能检测到绿色荧光。结果表明沙门氏菌多克隆抗体与除沙门氏菌外的菌株不发生反应，表明建立的流式细胞仪检测方法特异性良好。

2.3 流式细胞仪法检测死活菌的验证 沙门氏菌与偶联有FITC的多克隆抗体反应后，发出绿色荧光；而当沙门氏菌死菌和活菌与碘化丙啶反应后，只有死菌发出红色荧光。因此，通过流式细胞仪检测后，沙门氏菌活菌只会检测到绿色荧光，死菌会检测到红色和绿色两种荧光（如图2所示），说明流式细胞仪法可以有效区分沙门氏菌死活菌。

2.4 人工污染牛奶样品的检测 人工污染牛奶样品的检测结果显示（表1），当沙门氏菌的浓度在103 ～108 CFU/mL时，流式细胞仪法检测沙门氏菌的检测结果与添加浓度非常接近，说明流式检测方法准确性良好。而当沙门氏菌的浓度大于108 CFU/mL或者小于103 CFU/mL时，超出仪器检测限。因此，人工污染牛奶样品中流式检测方法的检测范围为1.83 × 103～1.99 × 108 CFU/mL，灵敏度为1.83 × 103 CFU/mL。

3 讨论

本研究所建立的流式细胞仪方法检测牛奶中沙门氏菌灵敏度为1.83 × 103 CFU/mL、特异性良好，检测时间仅需35 min，与传统的平板计数法、免疫胶体金试纸条法、电阻抗法以及荧光PCR方法相比较，检测时间明显地缩短。综上所述，本研究所建立的流式细胞仪检测方法不仅适用于液态牛奶的检测，同时也适用于奶粉样品的检测。因此本研究建立的方法可以快速、灵敏、高效地筛查奶粉是否被沙门氏菌污染。

参考文献

[1] 王毳，闫磊，曾庆祝.沙门氏菌的检测技术与方法[J].现代食品科技， 2007， 23（5）： 82-85.

[2] SRISA-ART M，BOEHLE KE，GEISS BH，et al. Highly Sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation[J].Anal Chem. 2018， 90（1）：1035-1043.doi： 10.1021/acs.analchem.7b04628.Epub 2017 Dec 20.

[3] 國家食品药品监督管理总局.食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验：GB/T 4789.4-2016[S].北京：中国标准出版社，2016.