利用CRISPR/Cas9技术高效建立FUS—GFP荧光报告细胞系

陈丽

【摘 要】 利用CRISPR/Cas9基因敲入技術建立稳定表达FUS（fused in sarcoma）的细胞系。方法：扩增FUS 5'arm序列，puro-T2A-GFP报告基因，FUS 3'arm序列，将3个片段一次连接至目的载体上。制作长链ssDNA做为同源重组模板。将FUS agRNA，cas9，ssDNA共转染hela和hct116细胞，通过细胞同源重组修复途径，实现报告基因GFP的敲入，嘌呤霉素筛选阳性细胞，流式分选纯化和富集带有绿色荧光的细胞，建立表达FUS-GFP融合蛋白的细胞系。结果：成功构建了带有FUS 5'arm + puro-T2A-GFP+ FUS 3'arm的靶向载体质粒。琼脂糖凝胶显示ssDNA的成功产生。共聚焦显微镜显示转染后药筛48小时的hela和hct116细胞均出现绿色荧光。流式分选显示，带有绿色荧光的细胞比例约为30%-40%。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功构建了FUS-GFP荧光报告细胞系。

【关键词】 CRISPR/Cas9；knock in；同源重组；ssDNA；FUS

【中图分类号】R365 【文献标志码】B 【文章编号】1005-0019（2018）24-001-01

规律成簇间隔短回文重复系统（CRISPR-Cas9）是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的 DNA序列切割造成双链DNA断裂，当存在同源模板的条件下，发生同源重组修复[1]，造成基因敲入（knock in）。这通常通过在插入DNA的任一侧构建具有0.5-1kb的两个同源臂的靶向载体来实现。目前，单链寡脱氧核苷酸（ssDNA）已被用作供体模板与工程化核酸酶的组合，并且比双链供体质粒更有效[2]。

FUS，全称为fused in sarcoma，是一种RNA结合蛋白，FUS在细胞核中富集，但在额颞叶痴呆（FTD）或肌萎缩侧索硬化（ALS）患者的死后脑和脊髓中，存在于神经元和神经胶质细胞的细胞质聚集体中[3]。已有报道，FUS发生相分离形成液态冷凝物，硬化成固态，这可能是神经退行性疾病中不容聚集体形成的原因。此外，FUS的入核转运可以溶解液态相分离结构，防止固态凝聚体造成的神经细胞毒性[4]。另外，FUS在DNA损伤中的功能涉及与组蛋白脱乙酰酶1的直接相互作用[5]。本研究拟构建FUS-GFP荧光报告细胞系，通过活细胞工作站，在X射线照射造成细胞DNA双链断裂的条件下，通过荧光观察FUS液滴融合或分离现象。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 方法

1.2.1 引物序列的设计

1.2.2 PCR法扩增目的基因序列 FUS 5'arm和FUS 3'arm以基因组为模板，puro-T2A-GFP以质粒为模板，用上述引物进行PCR扩增，使用PrimeSTAR高保真酶（Takara R010B），方法见说明书。PCR产物回收后，测浓度待用。

1.2.3 构建靶向载体 目的载体pcDNA3.1双酶切后，经电泳割取目的条带，回收测浓度。将线性化载体和上述3条PCR片段按比例混合，使用诺维赞多片段连接试剂盒（诺唯赞 C113-01），实现多个线性化DNA的重组。重组产物经转化，挑克隆鉴定后提质粒送测序。正确的靶向载体命名为pcDNA3.1-FUS-GFP。

1.2.4 Guide-it Long ssDNA system产生ssDNA 用适当的磷酸化引物以靶向载体pcDNA3.1-FUS-GFP为模板PCR产生dsDNA。

使用Guide-it Long ssDNA system（Clontech 632644）产生ssDNA，方法见说明书。

1.2.5 FUS sgRNA的构建

将上述寡聚核苷酸单链变性、退火后形成双链。双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-FUS sgRNA质粒。

1.2.6 转染hela细胞系和hct116细胞系 转染步骤见说明书（Invitrogen STEM00003）。转染后24h加药。之后每天换液加嘌呤霉素筛选阳性细胞。

1.2.7 阳性细胞的分选 加药条件下将细胞扩大培养至10cm盘。消化细胞，PBS重悬，过细胞筛收集于流式管上机。

3 结果

3.1 产生ssDNA 靶向载体按方法1.1.4产生ssDNA。将双链及单链DNA在琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图1。

3.2 荧光 转染后药筛48小时，可见hela和hct116细胞中均有绿色荧光，如图2。说明sgRNA和cas9在FUS的起始密码子附近造成DNA双链断裂，含有GFP以及两端各750bp同源臂的ssDNA侵入到DNA断裂处，通过细胞的同源重组修复途径，实现报告基因GFP的敲入。

3.3 流式分选 流式分选纯化和富集带有绿色荧光的阳性细胞，如图3。可见，hela细胞和hct116细胞中带有绿色荧光的细胞比例大约分别为33%和40%。

4 讨论

CRISPR/Cas9技术由于能快速，高效，简便地靶向基因组任何基因，在2012年开始像爆炸一般流行起来。近年来，相分离又成为生物学研究的一个热点，相分离与疾病的关系的研究主要集中在神经退行性疾病。FUS可以发生相分离，其在细胞质中聚集是患有额颞叶痴呆或肌萎缩侧索硬化的患者中的病理性标记。并且，DNA修复的缺陷与神经退行性疾病有广泛的联系，但确切的机制知之甚少。本研究构建FUS-GFP荧光报告细胞系，可以通过活细胞工作站，在X射线照射造成细胞DNA双链断裂的条件下，通过荧光观察FUS液滴融合或分离现象，从而方便研究FUS蛋白在DNA损伤修复等调节下的动态变化。

参考文献

[1] Maria Jasin and Rodney Rothstein. “Repair of strand breaks by homologous recombination.” Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 5.11 （2013）： a012740.

[2] Peng， Y. et al. Making designer mutants in model organisms. Development 141，4042–4054 （2014）.

[3] Mackenzie， I.R.， Rademakers， R.， and Neumann， M. （2010）. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Lancet Neurol.9， 995–1007.

[4] Guo，L.，et al.（2018）. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transtions of RNA-binding protein with prion-like domains.Cell，173（3），677-692.

[5] Wang WY.，et al.（2013）.Interaction of FUS and HDAC1 regulates DNA damage response and repair in neurons. Nature Neuroscience，16（10）：1383-91.