探究桂枝、附子配伍含药血清的制备方案

2018-02-15简旖沫汤小虎赖张凤

风湿病与关节炎 2018年12期

简旖沫汤小虎赖张凤

【摘要】目的：通过高效液相色谱法（HPLC）考察桂枝、附子配伍含药血清的制备方案。方法：将35只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、单倍剂量组、5倍剂量组、10倍剂量组和20倍剂量组，每组7只。分别采用单倍、5倍、10倍、20倍的给药剂量予桂枝、附子配伍灌胃，正常组予生理盐水灌胃。于给药后15，30，60，90，120，180，240 min肝门静脉取血，采用甲醇沉淀法、乙腈沉淀法、三氯乙酸沉淀法以及乙酸乙酯沉淀法对血清进行处理，通过HPLC技术对血清进行检测分析。结果：采用20倍剂量给药60 min后取血，经甲醇沉淀法处理制作的含药血清可以检测到入血成分较多，色谱峰的分离效果好、离子强度高且干扰小。结论：通过HPLC法考察含药血清的制备方案可以为探讨中药配伍入血成分的物质基础提供理论依据。

【关键词】关节炎，类风湿；含药血清；桂枝；附子；HPLC；采血时间；给药剂量

【ABSTRACT】Objective：To investigate the preparation of medicated serum containing Guizhi（Cinnamomum cassia Presl） and Fuzi（Aconitum carmichaeli Debx）by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：Thirty-five male Wistar rats were randomly divided into a normal group，a one-dose group，a five-dose group，a ten-dose group and a twenty-dose group，7 rats in each group.Rats in each treatment group were given intragastric administration with corresponding doses of Guizhi and Fuzi and those in the normal group were given intragastric administration with normal saline.Respectively after 15，30，60，90，120，180，and 240 minutes of administration，blood was collected from hepatic portal vein.Serum was treated by methanol precipitation，acetonitrile precipitation，trichloroacetic acid precipitation and ethyl acetate precipitation，detected and analyzed by HPLC.Results：Medicated serum was better in the twenty-dose group with blood taken after 60 minutes，whose chromatographic peaks had a good separation effect，with high ionic strength and little interference.Conclusion：The preparation scheme of medicated serum by HPLC can provide theoretical basis for exploring the compatible blood components of Chinese medicine.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；medicated serum；Guizhi；Fuzi；HPLC；blood collection time；dose of administration

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性、侵蚀性、全身性自身免疫性疾病，其基本病理改变为對称性关节滑膜炎，血管翳形成，并逐渐出现关节软骨和骨质的侵蚀与破坏，最终可导致关节畸形和功能丧失[1]。目前，治疗RA的常用药物为非甾体抗炎药、糖皮质激素和改善病情抗风湿药等，这些药物的不良反应较大，而生物制剂价格昂贵。结合我国几千年中医药治疗风湿病的特色及云南吴佩衡扶阳学术思想，以温阳通络法治疗风湿病为切入点，开展中医药防治风湿病，对提高人们健康水平具有重要的意义。通过临床实践及实验研究发现，温阳通络法对风寒湿痹型RA的临床症状有明显改善，可显著降低C-反应蛋白、红细胞沉降率、类风湿因子等指标[2]。其中桂枝、附子作为主要药物，具有温经通阳、散寒除湿之功，发挥蠲痹止痛之效[3-4]。药物经口服后通过消化道直接吸收入血，或经消化酶及肠内菌群分解成代谢产物被吸收入血。中药的有效物质最终都会以血液为媒介输送到不同的作用靶点发挥药效。建立中药入血成分的谱效关系，可以为进一步探讨桂枝、附子温经通络配伍治疗RA的药效物质基础研究提供理论基础。而含药血清制备过程以及检测技术等都没有统一的标准。本研究通过高效液相色谱法（HPLC），分别从给药剂量、采血时间、血清处理方面考察含药血清的制备方案，促进中医药国际化、标准化。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠35只，体质量（200±20）g；由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物使用许可证号SCXK（川）2013-24。

1.2 实验药品中药材桂枝、附子由云南省中医医院中药房提供，经云南省中医医院药剂科鉴定全部合格。

1.3 实验仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；分析天平（瑞士Metter T-oledo公司）；Biofuge Primo R离心机（德国Thermo Scientific Heraeus公司）；QT-1涡旋机（上海琪特分析仪器有限公司）；MD200-2氮气吹干器（深圳三利仪器公司）；Elmasonic S 900 H超声波清洗器（德国Elma公司）。

1.4 实验试剂甲醇、乙酸乙酯、乙腈、三氯乙酸（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；苯甲酰新乌头原碱（63238-67-5）、苯甲酰乌头原碱（466-24-0）、苯甲酰次乌头原碱（63238-66-4）、桂皮醛（89Z9-G2NP）、对甲氧基桂皮酸乙酯（XW99-CWBR）、肉桂酸（VUZS-DKSH）（中国药品生物制品检定所）。

1.5 检测条件 ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；水为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱程序为甲醇的体积分数1%（0～1.0 min），1%～3%（1.0～1.5 min），3%～32%（1.5～13.5 min），32%～60%（13.5～18.5 min），60%～90%（18.5～20.5 min）进行梯度洗脱；柱温25 ℃，流速5 μL·min-1；检测波长254 nm。

2 方法

2.1 分组与给药 Wistar大鼠35只，随机分为单倍、5倍、10倍、20倍剂量组和正常组，每组7只。根据云南扶阳流派临床常用生药剂量（桂枝20 g、制附子30 g）[5]，按照“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算出大鼠等效剂量[6]，实验组大鼠应当给生药量4.5 g·kg-1，即单倍剂量组予4.5 g·kg-1，5倍剂量组予22.5 g·kg-1，10倍剂量组予45 g·kg-1，20倍剂量组予90 g·kg-1，给药容积为1 mL·（100 g）-1。给药前大鼠禁食12 h以促进药物吸收。正常组予等量生理盐水。

2.2 供试品的制备分别取附子、桂枝饮片，打粉过60目筛，精密称定600 g，置圆底烧瓶中，按料液比1∶10加入体积分数为95%的乙醇。附子予超声清洗器中振荡提取50 min，浸泡1 d，回流提取2 h，提取2次，过滤，合并提取液，测定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，灭菌后置低温处保存备用[7-8]。桂枝予热回流提取2 h，连续3次，合并滤液，测定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，灭菌后置低温处保存备用[9]。

2.3 含药血清和空白血清的制备将大鼠麻醉后平躺固定于实验台上，用蘸有水的纱布把腹部被毛浸湿，再用剪刀紧贴皮肤剪去腹部被毛，然后用酒精棉球消毒腹部，用剪刀沿腹缝线自下向上打开腹腔，用钝器将肠等腹腔脏器分向一侧，将肝叶向上翻起，以暴露肝门静脉。用连接5 mL注射器的7号针头自上向下刺入静脉中，刺入瞬间慢慢抽拉注射器活塞杆直至取血完成。分别于给药后15，30，60，90，120，180，240 min肝门静脉取血0.5 mL。

待血液凝固后，置于离心机以4 ℃，12 000 r·min-1离心3 min分离血清，同组血清合并，分别采用甲醇沉淀法、乙腈沉淀法、三氯乙酸、乙酸乙酯沉淀法对血清进行处理，经0.22 μm微孔滤头过滤即得，每支0.5 mL分装，-80 ℃条件下保存备用。正常组血清为空白血清。

2.4 对照品溶液的制备分别精密称定桂皮醛、肉桂酸、对甲氧基桂皮酸乙酯、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品适量，加入甲醇制备成每毫升含10 μg·mL-1的溶液。

2.5 方法学考察本研究为定性实验，通过记录桂皮醛对照品、肉桂酸对照品、对甲氧基桂皮酸乙酯对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品，以及空白血清的色谱图，观察相同保留时间处空白血清色谱图是否检测出对照品的色谱峰，考察分析方法的专属性。如图1所示，桂皮醛、对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱，及大鼠血清内源性物质均实现基线分离，且在对照品色谱峰的“信号窗”（信号附近的有限范围）内没有出现内源性物质信号的干扰。

3 结果

3.1 血清样品处理方法的考察精密吸取每组血清0.2 mL，分别加入甲醇、乙腈、三氯乙酸、乙酸乙酯至1 mL，按比例1∶5，涡旋混匀10 min，离心机以10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，氮气吹干后，200 μL甲醇复溶，过0.22 μm滤膜滤过除菌，每支0.5 mL分装，-20 ℃条件下保存备用。结果显示，通过甲醇沉淀法制备的血清样品，可以检测到的入血成分较多，色谱峰的分离效果好、离子强度高且干扰小。以20倍剂量组为例，各种沉淀法色谱图见图2。

3.2 给药剂量的考察分别将单倍、5倍、10倍、20倍剂量组含药血清及正常组空白血清样品通过甲醇沉淀法处理后，予HPLC进行检测分析。结果显示，20倍剂量组血清样品可以检测到的入血成分较多，色谱峰的分离效果好、离子强度高且干扰小。见图3。

3.3 采血时间的考察分别将20倍剂量灌胃后15，30，60，90，120，180，240 min肝门静脉取血的含药血清及空白血清样品通过甲醇沉淀法处理后，予HPLC进行检测分析。结果显示，灌胃60 min后取血清样品可以检测到的入血成分较多，色谱峰的分离效果好、离子强度高且干扰小。见图4。

4 讨论

RA是慢性、侵蚀性、全身性的自身免疫疾病。西藥不良反应大，价格成本高，开展中医药对风湿病的防治和提高人民群众健康水平意义重大。桂枝具有发汗解肌、温经通脉、助阳化气、散寒止痛的功效。附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效。前期课题对促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6的调控作用进行研究，结果显示，桂枝、附子配伍能不同程度降低风寒湿痹胶原诱导性关节炎大鼠模型异常升高的TNF-α、IL-1β、IL-6，对关节滑膜细胞增生、炎症浸润及关节破坏有不同程度的抑制作用[10]。然而，中药及复方的药效发挥是多种化学成分相互作用的综合效果。王喜军[11]认为，中药的药效物质基础是衡量中药有效性的基本标志，建立中药谱效关系是实现中药现代化、国际化的关键环节[12]。以中药口服给药后的血清为指标，采用现代科技，从血清中分离、鉴定移行成分则能更直接、客观地反映中药药代动力学的特点，可以为进一步探讨桂枝、附子温经通络配伍治疗RA的药效物质基础研究提供理论基础。

在近20年的发展中，中药血清药化学在方法学方面做了诸多改进；但含药血清制作过程评判等均没有统一的标准，这使得实验结果备受争议。本课题分别从给药剂量、采血时间、血清处理方面对含药血清的制备进行考察，做出综合技术评定，监测有效成分在各时间点血药浓度的变化，对含药血清的制备进行较为系统的研究。由于含药血清中药物成分含量低、内源性物质干扰以及仪器设备等客观条件影响，低剂量给药几乎检测不到血中移行成分，且不能无限制地增加取样量，结合相关文献及大鼠对药物剂量的承受影响，故采用单倍、5倍、10倍、20倍剂量对大鼠灌胃进行研究。实验结果显示，20倍剂量给药制作的含药血清检测到的血中移行成分的数量多。血液中含有大量的酶和蛋白，这些内源性物质可继续降解血清中的药物成分，干扰检测，同时损害仪器。故血清样品分析检测前需去除蛋白等物质，将与蛋白质结合的药物成分释放出来，降低干扰，准确地测定吸收入血的药物原型成分以及代谢产物。通过查阅相关文献显示，常见的去除蛋白的方法有溶剂处理、酶水解处理及热水浴处理法等。酶水解法不适用于碱性条件下容易水解的成分，而热水浴法只能去除热变性蛋白，故采用溶剂处理血清。加入与水相混溶的有机溶剂可使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使蛋白质结合的成分释放出来[13]。目前，常见蛋白质沉淀法主要有甲醇、乙腈、三氯乙酸、乙酸乙酯，本实验结果显示，使用甲醇沉淀法制备桂枝、附子的含药血清，可以检测到入血的药物成分较多，且干扰少。中药所含化学成分十分复杂，血清中不同药物成分的达峰时间也不同。本实验通过对灌胃桂枝、附子配伍后不同时间采血的含药血清色谱图的考察，分析给药后血清中药物成分的动态变化过程。结果显示，给药后60 min取血的血清样品可以检测到的入血成分多，色谱峰的分离效果好、离子强度高且干扰小。由于气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而附子含有较多大分子物质，液相色谱可以分离生物大分子，故采用HPLC对含药血清进行分析。然而中药含药血清中的化合物较多且药物成分含量极低，杂质干扰大，HPLC灵敏度相对较低，导致检测结果欠理想。未来可以采用HPLC-DAD/MS、LC-MS/MS、HPLC-DAD-MS/MS及GC-MS等分析技术，有较好的成分分离能力且检测灵敏度高，能够对复杂样品中的多种成分进行定性和定量分析。

通过HPLC考察含药血清的制备方案可以为探讨中药配伍入血成分的物質基础提供理论依据。对确立中药药效物质基础的研究具有深远影响，对于阐明中药复方的组方原理、作用机制，促进临床合理使用中药等都具有重要的意义。

5 参考文献

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