PMA在活菌检测中的应用

(南召县动物卫生监督所, 河南 南召 474650)

1 叠氮溴化丙锭的介绍

叠氮溴化丙锭（PMA）是一种光敏反应染料，它对DNA具有非常高的亲和力。当细胞膜处于不完整状态或者细胞已经死亡，细胞膜对外界的物质的进出就没有了选择性，PMA就可以顺利进入细胞内，与DNA进行结合，在光照作用下发生交联反应。交联后的DNA就不能作为模板进行扩增，残留在溶液中的未被结合的PMA在光照下与水分子形成羟胺化合物，从而阻止其与在提取过程中活菌产生的DNA结合，影响检测结果。而对于活的细胞而言，细胞膜具有选择性，PMA便不能进入细胞内与DNA进行交联反应。将PMA这种特性与荧光定量PCR技术进行偶联，便可以实现对活菌的检测[1]。

2 影响活菌检测的因素

2.1 采集的样品

PMA偶联荧光PCR技术对样品的要求比较高。有研究发现，环境中的样品，食品样品和临床上的病料中常常含有一些无机物质，有机物质。这些物质的存在既可以降低PMA的有效浓度，也可以干扰PMA与核酸的交联反应。详细的说，样品中的无机物和有机物会造成样品的浊度提高，样品越浑浊，光的透过性就越差，越影响PMA与样品在光照条件下的交联反应。为了避免和减少因样品采集带来的误差，Luo等人在一项研究中提出，要严格规范浊度的阈值，这样对每一份样品检测具有更重要的意义和参考价值。有研究表明，当样品的浊度达到10个散射浊度单位的时候，样品的浊度对于PMA交联DNA是没有影响的。当样品的浊度高于10个散射浊度时，样品的浊度对于PMA交联DNA具有非常大的影响。

2.2 PMA与DNA作用阶段

PMA与DNA作用阶段主要是指PMA进入细胞膜受损伤的过程和PMA结合DNA的过程。PMA是一种对光较为敏感的染料，即便在普通光源下，也能降低PMA的有效浓度。因此，在PMA与细胞核DNA作用的过程中要避光。在这个过程中，PMA的浓度、PMA与核酸的作用时间，温度等都会影响最终的检测结果。有些学者在参考别的研究者活菌检测技术时，设置了同样的温度、浓度和时间，但是结果却不甚理想。其主要原因是样品不同，最佳的PMA的浓度和作用时间也会有很大的差异。如较低浓度时，PMA是不能够完全结合掉所有的死菌DNA，那么部分没有结合的死菌的DNA便可以作为模板被扩增出来，从而造成活菌检测数据不准确。如果PMA的浓度过高，PMA也可以渗入到活的细胞中，将部分活的细胞DNA结合掉，造成检测结果的不准确。因此，无论是做哪一项活菌检测，PMA的浓度和作用时间等参数要先优化，后使用。PMA进入细胞的效率和有效结合DNA的效率还与温度有关。有研究表明。在室温的条件下，PMA结合DNA的效率最高。另外，PMA与细胞的作用时间也要考虑到位。作用时间过长，PMA也能够渗透到活细胞中，造成结果的不准确[2]。

2.3 PMA与DNA的交联

在光照条件下，PMA与DNA能够发生交联反应。但是有效的交联反应仍然依赖于光源和光处理时间的长短。光源的光谱不同时，PMA的激活效果也存在很大的差异。最为合适的光源是光的波长能够有效激发PMA分解。研究表明，500～750w的金属卤素灯是最佳的光源。光照时，样品要放在光下20～30cm处，保障PMA与样品中的DNA有效交联。但是值得注意的是，在较高功率的卤素灯照射下，部分活菌会严重受热死亡。为了避免这种现象的发生，Vesper等人首次将发光二极管代替卤素灯，这样既保障了激发PMA的最佳发射波长，又避免了热量造成的活菌的死亡。光照时间是整个处理中不可小觑的环节。样品，实验条件的不同，光照时间也会有很大的差异。一般情况下，光照时间控制在20min以内。光照时间过短，PMA与DNA的交联反应不彻底，同时，残留在液体中的游离的PMA也不能完全失活。较长时间的光照时间又会引起活菌的死亡。因此，需要选择恰当的光照时间。

3 目标基因的选择

除了以上信息需要考虑外，目标基因的位置和片段的大小也会影响最后的检测结果。Soejima在用PMA偶联PCR技术检测单增李斯特菌的过程中发现，片段越长，PMA对荧光PCR的抑制效果越明显。还有学者认为，对于同一种细菌检测时，运用不同的片段，检测得到的结果差异非常显著[3]。

4 PMA偶联荧光PCR的应用

Zhu等人用PMA-qPCR检测样品中的副溶血性弧菌的活菌量时发现，PMA的最佳浓度时8ug/mL，并且当细菌的浊度低于10个NTU时，OD值低于0.8时，PMA能够有效抑制死菌的扩增。黄韵等人运用PMA-qPCR检测技术成功检测出处于VBNC状态下的单增李斯特菌活菌。Li等人在用PMA-qPCR检测沙门氏菌活菌检测，并对基因片段的长度进行优化和选择，结果表明，PMA对死菌DNA的抑制作用与核酸片段长度有关，核酸片段长度越长，PMA对死菌的抑制作用越好。当长度高于260bp时，检测的灵敏性会突然下降。长度低于130bp时，则无法有效抑制死菌DNA的扩增。

[1]陈丽芬.两种实验方法检测食品中金黄色葡萄球菌的比较和分析[J].医学动物防制,2016(05)：581-582+58.

[2]吴碧文.金黄色葡萄球菌在不同食品中的检出率分析[J].福建分析测试,2015(02)：51-54.

[3]张崇娥.不同食品中金黄色葡萄球菌的检出分析[J].求医问药(下半月),2012(07)：9-10.