FBXO5在结直肠癌中的表达及临床意义

周启明 赵 艳 付晓红 段江曼 康文全

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)在全球癌症中发病率居第四位，死亡率居第二位。CRC患者五年生存率为64.3%，当晚期CRC发生远处转移时，五年生存率仅为5%～8%[1-2]。约50%～60%CRC患者就诊时已发生转移，治疗手段非常有限[3]。目前，CRC发生及转移的机制尚不清楚，研究CRC中异常表达分子在CRC转移中的作用及调控机制，不仅有助于进行准确的CRC分子分型、潜在的治疗靶点的发现，而且有助于CRC的早期诊断和生存期的延长[4-6]。

FBXO5又名早期有丝分裂抑制物(Emi1)属于F-box家族蛋白，可参与组成Skp1-Cul1-F-box-protein (SCF)泛素连接酶，介导蛋白的泛素化降解[7]。我们的研究发现：FBXO5在CRC组织表达升高；FBXO5高表达与CRC患者不良预后密切相关，可以作为结直肠癌的一个新的预后指标和潜在的治疗靶点。

材料和方法

一、主要试剂

Cocktail 蛋白酶抑制剂(Calbiochem)，丙烯酰胺(Bio-Rad)，TEMED(Sigma addrich)，PVDF膜(Roche)，BSA(Promega)，Anti-FBXO5 抗体(HPA029048，sigma aldrich)。5×SDS-PAGE上样缓冲液：取1 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)1.25 ml，0.5 g SDS，2.5 mL甘油，25 mg 溴酚蓝加去离子水定容至5 mL，每只500 μL分装，用前每小份加入25 μL β巯基乙醇。5xSDS-PAGE 电泳缓冲液：称取15.1 g Tris base，94 g 甘氨酸，5.0 g SDS，加入800 mL 去离子水，搅拌溶解，定容至1 000 mL。膜转移缓冲液：称取5.8 g Tris base，2.9 g 甘氨酸，0.37 g SDS，加入600 mL 去离子水，搅拌溶解，定容至800 mL，加入200 mL甲醇。10×TBE：540 g Tris 碱与275 g 硼酸溶于1 000 mL 0.5 mmol/L EDTA 中。1.2% Agarose：Agarose 1.2 g，溶于1×TBE 50 mL 中，微波加热沸腾后制胶。0.5 mol/L EDTA缓冲液(pH8.0)：700 mL水中溶解186.1 g EDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH 8.0，加去离子水至1 000 mL。

二、主要方法

1. RT-PCR

采用RNeasy Mini试剂盒分离纯化总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。参照OneStep RT-PCR试剂盒实验操作说明进行RT-PCR，总反应体积50.0 μL，其中5×OneStep RT-PCR buffer 10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5×Q-Solution 10.0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA 1.0 μg，引物 0.6 μmol/L。扩增条件为：50 ℃逆转录30 min，95 ℃初始化15 min，94 ℃变性1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30～35个循环，72 ℃ 10 min。扩增引物为：5′-GCTGTCATGTATTGGGTCACC-3′ (forward)，5′- GTCTACTGGTCTCTAGTGCTTCT-3′ (reverse)，扩增产物大小为：146 bp，取RT-PCR产物10.0 μL，加上样缓冲液2.0 μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，70 V 40 min，凝胶图像成像系统拍摄保存实验结果。

2. Western Blot

(1)SDS-PAGE电泳 电泳：样品中加入1/5体积的5×SDS-loading buffer，99 ℃煮5 min充分变性。将凝胶固定于电泳装置上，加入电泳缓冲液。每空约50 μg的总蛋白量上样。浓缩胶稳压80 V，分离胶120 V，电泳至溴酚蓝达分离胶底部时，关闭电源。

(2)转膜 PVDF膜纯甲醇浸泡饱和30 s，按海绵→滤纸→胶→膜→滤纸→海绵，每层放好后，用玻璃棒赶去气泡。胶放于负极面(黑色面)。将转移槽置于冰浴中，将夹子夹好放入转膜槽，加转移缓冲液，200 mA恒流2～4 h。

(3)封闭以及抗体孵育 用镊子小心夹出PVDF膜放入5%的脱脂奶粉中室温封闭2 h。一抗孵育：弃去封闭液，TBST清洗2次，用3%的BSA稀释Anti-FBXO5抗体，与膜一起4 ℃孵育过夜。用TBST洗膜三次，每次10 min。二抗孵育：HRP偶联的二抗用5%的脱脂奶粉/TBST按1:10 000稀释，室温孵育1 h。TBST洗膜三次，每次10 min。

(4)显色、X光片压片，显影、定影。

3. 免疫组织化学技术(IHC)

收集2004年5月至2009年11月深圳市南山区人民医院收治的240例结直肠癌患者手术病例相关临床病理资料，结直肠癌标本、阴性对照组织以及阳性对照组织切片后按以下步骤免疫组织化学染色(IHC)：

(1)脱蜡：0.45 μm石蜡切片60 ℃温箱烤片2 h；将切片取出后立即放置新鲜二甲苯缸中，浸泡10 min：重复一次；

(2)梯度水化：将脱蜡后的切片依次经100%乙醇，95%乙醇，80%乙醇，60%乙醇，蒸馏水中梯度浸泡各3 min；

(3)去除内源性过样化物酶的活性：将玻片甩干，置于3% H2O2中，室温孵育30 min；

(4)高压抗原修复：将组织切片放入盛有的EDTA修复液(1 mmmol/L pH 8.0)高压锅中，高压3～4 min，从高压锅气阀弹起冒气时开始计时；自然冷却1 h；取出放入蒸馏水中，浸泡3 min；

(5)PBS洗涤3次，每次5 min；

(6)IHC油性笔绕组织切片周围划圈，圈好后滴加羊血清封闭30 min；

(7)一抗孵育：Anti-FBXO5 抗体按1∶100稀释，覆盖整张组织切片区域，4 ℃孵育过夜；

(8)PBS缓冲液洗涤4次，每次3 min；

(9)二抗孵育：滴加二抗，室温孵育1 h；

(10)PBS洗涤4次，每次3 min：

(11)DAB显色2～3 min，清水冲洗终止反应；

(12)苏木素复染1～2 min，盐酸酒精分化1～3 s；

(13)脱水干燥：30%乙醇，70%乙醇，100%乙醇梯度脱水，37 ℃温箱烤片10～20 min；

(14)中性树脂封片，观察。

阳性结果判定标准：两名临床病理医师双盲法分别对染色情况作出评分。细胞内呈棕色颗粒者为阳性染色，根据染色细胞所占百分比和染色强弱的程度进行评分。阳性细胞率计分分为四个等级： 0分(≤10%)，1分(11%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(>75%)。染色强弱的强度分为4个等级： 1分(浅棕色)，2分(棕色)，3分(深棕色)。最后总的染色情况按二者的乘积分数分为4个等级：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。结果判断：将(-)和(+)定为阴性表达，(++)和(+++)定为阳性表达。

三、统计方法

应用SPSS 16．0统计软件对研究数据进行处理。Pearson Chi-Square 和Kruskal-Wallis 检验分析FBXO5表达与临床病理学指标的相关性，Kaplan-Meier method 和log-rank test分析临床预后，Cox regression回归模型进行单因素和多因素分析。等级变量如临床分期、T分期和病理分化等按连续变量处理放入模型进行分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、FBXO5在结直肠癌中表达升高

采用RT-PCR和Western blot检测FBXO5在结直肠癌的癌组织和癌旁组织临床标本中的mRNA和蛋白的表达。如图1所示，PCR结果显示，6例配对标本中，与相应配对的癌旁组织相比，癌组织中标本中的FBXO5的mRNA表达明显升高(图1A)。Western blot结果显示，12例配对标本中，与相应配对的癌旁正常组织相比，癌组织中FBXO5的蛋白表达也明显升高(图1B)。

图1 FBXO5在结直肠癌患者手术新鲜标本中mRNA(A)和蛋白(B)的表达 T：肿瘤组织，N：非肿瘤组织

二、FBXO5表达与结直肠癌临床病理特征的相关性

免疫组织化学技术检测240例确诊的具有临床病理和预后资料的结直肠癌患者石蜡标本中FBXO5的表达(240例结直肠癌患者的临床资料见 表1)，其中28例临床Ⅰ期(11.7%)，67例临床Ⅱ期(28.0%)，90 例临床Ⅲ期 (37.5%)以及 55 例临床Ⅳ期(22.9%)，病理医生评分后，根据ROC曲线得出cut off值为5，以IHC评分值是否》5分为高表达和低表达组，Pearson Chi-Square 和Kruskal-Wallis 检验统计学方法分析FBXO5表达与临床病理学特征的相关性。从表1可见，FBXO5表达与结直肠癌患者的临床病理特征密切相关：临床分期 (P=0.004)，T分期 (P=0.009)，M分期 (P=0.003)。FBXO5表达高的结直肠癌患者临床分期越高，FBXO5高表达的结直肠癌患者发生远处器官转移的比例越高。

表1 FBXO5表达与结直肠癌临床病理特征的相关性 (n=240)

*P<0.05

三、FBXO5高表达预示结直肠癌患者不良预后

进一步采用Kaplan-Meier 分析 和the log-rank test统计学分析FBXO5表达和结直肠癌患者预后的关系，从图2、图3可见，FBXO5高表达的结直肠癌患者的总生存期比FBXO5表达低的患者短(P< 0.001)，FBXO5高表达预示结直肠癌患者预后差。

a：FBXO5表达低染色弱CRC组织；b：FBXO5表达高染色强CRC组织；c：FBXO5不表达的阴性对照组织；d：FBXO5有表达且染色定位准确的阳性对照组织

图2 FBXO5在结直肠组织中的表达(IHC，×100)

图3FBXO5高表达与结直肠癌患者预后的关系

通过Cox回归模型进行对生存相关因子进行单因素和多因素分析，单因素分析显示(见表2)，与结直肠癌患者总生存期明显相关的因素包括：FBXO5表达(P=0.012)，T分期(P< 0.001)，N 分期(P< 0.001)，M 分期 (P< 0.001)和病理分化(P< 0.001)。多因素回归分析结果显示(见表3)，FBXO5表达，N 分期和 M分期是结直肠癌患者总生存期的独立预后因素，FBXO5表达(P=0.045，HR 1.53，95%CI 1.01～ 2.31)，N 分期(P< 0.001，HR 6.12，95%CI 2.59～14.49)和M分期(P< 0.001，HR 2.56，95%CI 1.68～3.90)。

表2 FBXO5的Cox回归模型单因素

注：HR: 风险比; CI：可信区间; 多分类变量数据按哑变量处理，其中临床分期表示Ⅲ、Ⅳ分期与Ⅰ+Ⅱ分期的比较；T分期表示T3、T4分期与T1+T2分期的比较；病理分化按差、中等分化与良性分化比较

表3 FBXO5的Cox回归模型多因素分析

注：HR: 风险比; CI：可信区间; 多分类变量数据按哑变量处理，其中T分期表示T3、T4分期与T1+T2分期的比较；病理分化按差、中等分化与良性分化比较

讨 论

结直肠癌的发生发展是一个多基因、多步骤、多阶段的过程，涉及多种癌基因的激活和抑癌基因失活等一系列的变化。APC、p53、K-RAS、BRAF、PIK3CA、SMAD4、FBXW7和PTEN等基因表达失调和染色体不稳定等是与结直肠癌发生发展，判断其预后及对药物治疗敏感性密切相关的分子生物学变化[5,8-9]。研究结直肠癌发生发展的病理过程中异常表达的生物大分子，有助于阐明结直肠癌发生的分子机制以及发现结直肠癌药物治疗靶点。

FBXO5是E2F转录因子的靶基因，是一个关键的细胞周期调节蛋白，为聚集有丝分裂期周期蛋白和S和G2期其他的重要细胞周期调控因子所必须[10-11]。FBXO5在一些癌上高表达且发挥重要功能。慢性髓样白血病(CML)中，Bcr-Abl增强Emi1的磷酸化和稳定性，进而阻止SKP2的降解促进CML细胞的增殖[12-13]；在肝细胞癌中Emi1促进增殖，调控SKP2稳定性和p27降解[14-15]。Emi1与卵巢透明细胞癌的高FIGO分期和不良预后相关[16]。乳腺癌中，Emi1与组织学级别和预后相关，影响PI3K/Akt细胞增殖通路[17-18]。敲除Emi1增强肿瘤细胞对阿霉素和X射线辐照敏感性。然而，FBXO5在结直肠癌中的表达及临床意义尚未明确。

在此项研究中，我们发现FBXO5在结直肠癌中存在表达失调，与癌旁组织相比，肿瘤组织中FBXO5在mRNA和蛋白水平的表达都有上调的趋势，并且在临床分期越高的结直肠癌患者FBXO5表达越高；病理分化越差的结直肠癌患者FBXO5表达也越高。FBXO5高表达的结直肠癌患者的生存期比FBXO5低表达的患者短。FBXO5高表达预示结直肠癌患者预后不良。我们目前的研究结果提示FBXO5在结直肠癌上可能会具有癌基因作用。对于FBXO5在结直肠癌的发展中作用及其具体分子机制，有待于将来进一步采用基因敲除或过表达等手段进行功能研究。

综上所述，FBXO5在结直肠癌中表达失调升高，FBXO5高表达与结直肠癌转移密切相关，且预示结直肠癌患者的不良预后。FBXO5可以作为结直肠癌的一个新的预后指标。我们在CRC上对FBXO5分子的研究结果可以为结直肠癌诊断的分子分型以及个体化治疗提供一定的理论依据，也可为CRC的治疗提供潜在的治疗靶点。