间隙连接蛋白Connexin 43介导的胶质瘤替莫唑胺耐药研究进展

覃虹锟，桂艳萍，王亚菁，赵 丽*

(中国药科大学 1江苏省肿瘤发生与干预重点实验室；2天然药物活性组分与药效国家重点实验室；3基础医学与临床药学学院生理学教研室，南京 210009)

胶质瘤是一种常见的中枢神经系统恶性肿瘤。在我国每年大约有10万人被确诊为胶质瘤，超过6万人因胶质瘤死亡，胶质瘤防治工作形势严峻[1]。目前胶质瘤的临床治疗以手术、化疗和放疗联合治疗为主；尽管如此，患者的无进展生存期约为5～7个月，中位生存期也仅停留在12～14个月，5年生存率低至3%～5%[2]。

替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是我国治疗胶质瘤的一线用药，单用或与放疗联用治疗新诊断的神经胶质瘤[3]，其能透过血-脑脊液屏障到达病灶，并通过烷化DNA起到抗肿瘤作用[4]。替莫唑胺的应用显著提高了胶质瘤患者的无进展生存期和总生存期，然而临床数据显示，仅有45%的患者对替莫唑胺产生响应，且随着用药时间推移，响应率逐步降低，患者出现耐药[5]。为了提高替莫唑胺的疗效，各国学者对其耐药机制进行了深入探究，以求延长患者生命。

Cx43是中枢神经系统中表达最丰富的间隙连接蛋白[6]，其与胶质瘤的恶性生物学行为有着密切联系[7]，近年来的研究表明Cx43可能是影响替莫唑胺疗效的原因之一。本文主要对Cx43与胶质瘤替莫唑胺耐药的关系的研究进行总结，以期为提高替莫唑胺疗效提供理论参考和依据。

1 间隙连接与Cx43

间隙连接是哺乳动物细胞间进行物质交换和信号传递的重要通道。6个相同的间隙连接蛋白排列形成中心孔径为2～4 nm的连接子形成半通道，可与相邻细胞的细胞膜上的半通道组成通道[8]。离子(Na+、K+、Ca2+、Cl-)，第二信使[环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸尿苷(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)]，小分子代谢物(葡萄糖、氨基酸)和microRNA等物质可通过间隙连接在细胞间传递，从而保证细胞间电耦合或生化耦合以维持细胞稳态[7]。人类基因组中有21种连接蛋白编码基因[9]，其中由GJA1基因编码的Cx43是人体组织中表达最丰富的间隙连接蛋白。Cx43的肽链由N末端、2个胞外环、4个跨膜区域、1个胞内环及C末端组成[10]，其中2个胞外环和C末端是Cx43发挥功能的主要区域，决定着间隙连接通道的形成及其功能(图1)[11]。

Cx43在胶质瘤发生、恶性增殖、侵袭以及耐药中起重要作用[12-15]。Crespin等[16]对85例胶质母细胞瘤手术样本进行分析，发现约60%的胶质瘤样本存在Cx43蛋白高表达，且表达与胶质瘤恶性程度呈正相关。但是，Caltabiano等[17]对32例星形胶质细胞瘤样本进行分析，发现Cx43蛋白表达与恶性程度呈负相关。通过对肿瘤和肿瘤基因图谱(Cancer Genome Atlas,TCGA)和R2 database的数据进行分析(图2)，发现胶质瘤组织中的GJA1 mRNA表达显著高于正常脑组织，且高表达GJA1的胶质瘤患者总生存期显著低于低表达患者。Cx43在胶质瘤中表达差异较大，这可能和胶质瘤发展过程及其所处的微环境密切相关。

Figure1 Schematic of Connexin 43 (Cx43)

2 替莫唑胺耐药的分子机制

替莫唑胺作为一种能透过血-脑脊液屏障的烷化剂，通过烷基化DNA分子上鸟嘌呤第6位氧原子上和第7位氮原子发挥细胞毒作用，诱导胶质瘤细胞凋亡[18]。

2.1 DNA损伤修复

O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)介导的DNA损伤修复是胶质瘤患者出现替莫唑胺耐药的最主要原因。MGMT通过不可逆地将烷化基团从O6-甲基鸟嘌呤(O6-MeG)残基转移到MGMT 蛋白145位的半胱氨酸残基以修复替莫唑胺带来的DNA损伤[19]。近年来，研究者通过甲基化特异性PCR技术发现胶质瘤级别与MGMT启动子甲基化程度呈显著负相关，与MGMT蛋白表达呈正相关，且在胶质瘤细胞中沉默MGMT基因能显著提高替莫唑胺治疗效果[18,20-21]。Hirohata等[22]通过分析胶质瘤手术样本发现错配修复蛋白6(mismatch repair protein，MSH6)也能修复替莫唑胺造成的DNA损伤，降低替莫唑胺药效。随着研究的深入，MutL homolog 3(MLH3)、ERCC家族和XRCC家族等DNA损伤修复蛋白在化疗耐药中的作用也逐渐被人们发现，可能成为逆转替莫唑胺耐药的靶点[23-25]。

Figure2 Relative expression of gap junction protein,alpha-1 (GJA1) in glioblastoma multiforme (GBM) and normal brain (left).Pateint data was retrieved from Cancer Genome Atlas (TCGA).Kaplan-Meier overall survival analyses of GJA1 low (red) and GJA1 high (blue) glioma patients.The survival time of glioma patients (x-axis) is defined as months after diagnosis(right).Pateint data was retrieved from the R2 database

2.2 ATP结合盒转运蛋白外排

胶质瘤细胞内替莫唑胺的药物浓度取决于细胞对于药物的摄取和外排。替莫唑胺是一种亲脂性分子，可以通过主动运输摄入细胞内，但是细胞膜上的转运蛋白可通过外排作用降低细胞内替莫唑胺浓度，其中ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette，ABC)家族发挥重要作用[26]。P-糖蛋白(P glycoprotein,P-gp)是一种由MDR1基因编码的ATP依赖型排出性膜转运蛋白。通过对112例手术样本进行分析，Schaich等[27]发现MDR1基因表达水平高的胶质瘤患者对替莫唑胺响应率较低，预后差。Munoz等[28]用P-gp抑制剂联合替莫唑胺对胶质瘤细胞进行处理，相比替莫唑胺单用组，联合用药组细胞内Caspase-3蛋白表达增加，凋亡增加。除P-gp外，多药耐药相关蛋白(MRP)、肺癌耐药性相关蛋白(lung resistance related protein,LRP)和ABCG2(ATP-binding Cassette Sub-family G Member 2)等外排蛋白在胶质瘤中表达均有增加，和替莫唑胺耐药密切相关[29-31]。

2.3 胶质瘤细胞自噬

自噬是细胞遇到缺氧、辐射、饥饿或DNA损伤等情况下采取的一种自我保护机制，其通过形成自噬体包裹目标细胞器或胞质内的大分子物质，再由自噬体与溶酶体结合降解这些细胞中多余的或已失去功能的内容物，以维持细胞稳态[32-33]。近年来研究表明，治疗剂量(每日75 mg/m2)下替莫唑胺能导致O6-MeG损伤并诱导胶质瘤细胞产生自噬，引起替莫唑胺耐药[34]。对于不可手术切除的胶质瘤患者，临床多采用放疗联合替莫唑胺化疗的方式进行治疗[4]，放疗作为一种强大的DNA损伤途径能引发胶质瘤细胞产生自噬[35]，这种自噬也可能是导致替莫唑胺耐药的一大原因。在体内外实验中，通过使用氯喹(chloroquine)等自噬抑制剂均能显著增强替莫唑胺对胶质瘤的凋亡作用[36-38]。截至2018年9月，已有2项氯喹联合替莫唑胺的治疗方案分别进入Ⅰ期临床(NCT02378532)和Ⅲ期(NCT03243461)临床试验阶段[39-40]。

3 Cx43介导胶质瘤替莫唑胺耐药的研究

胶质瘤对替莫唑胺耐药不仅是单个细胞的生物学行为，还需将肿瘤细胞置于所处的微环境中，考虑肿瘤细胞之间的相互作用，甚至肿瘤细胞和周围基质细胞之间的相互作用。

3.1 胶质瘤细胞间Cx43介导替莫唑胺耐药

Cx43作为细胞膜上的通道蛋白，大量研究表明其表达或功能异常可能是导致替莫唑胺耐药的重要原因。在LN229胶质瘤细胞中过表达Cx43能显著降低Bax/Bcl-2蛋白的比例，并减少线粒体细胞色素C的释放，导致替莫唑胺耐药[15,41]。Munoz 等[42]随后发现，经替莫唑胺长期处理后的U87胶质瘤细胞Cx43表达上调，并通过EGFR1-JNK-ERK-AP1轴形成耐药性，敲除Cx43后，替莫唑胺诱导的凋亡显著增加。Beahm等[43]通过构建Cx43 C末端截短突变，发现可以通过减弱Cx43与ZO-1、PKC和β-catenin等蛋白相互作用影响其通道与非通道功能；将Cx43第154位苏氨酸定点突变为丙氨酸(T154A)，可以使相邻细胞间形成正常间隙连接通道，但不具备胞间通讯功能[44]；在此基础上，Gielen等[15]发现完整的Cx43 C末端结构和Cx43介导的细胞间通讯是其导致胶质瘤替莫唑胺耐药的重要因素。同样，使用间隙连接抑制剂甘珀酸(carbenoxolone,CBX)后在体内外都显著增强了替莫唑胺的药效[45-46]。为了研究Cx43与MGMT的关系，Lai等[47]通过体外诱导胶质瘤替莫唑胺耐药细胞发现其Cx43和MGMT的表达均显著增加。但也有研究指出在MGMT缺失的胶质瘤细胞中，高表达Cx43的细胞可通过激活AKT-AMPK-mTOR通路降低对替莫唑胺敏感性[48]。综上所述，Cx43介导的胶质瘤替莫唑胺耐药可能不是依赖MGMT的，而可能与其形成的间隙连接通道和C末端活性形式相关。

3.2 胶质瘤与周围细胞间Cx43介导替莫唑胺耐药

在胶质瘤微环境中存在着大量的基质细胞，包括胶质细胞、神经元细胞、内皮细胞及免疫细胞等多种细胞[49]。胶质瘤与周围细胞间基于Cx43形成的间隙连接可能也是影响胶质瘤替莫唑胺耐药的原因。

脑组织中胶质细胞分布最广，约占人脑体积的50%，其中星形胶质细胞又是胶质细胞中比例最大的细胞[50]。星形胶质细胞在维持中枢神经系统稳态中发挥重要作用，参与形成血-脑脊液屏障，可通过调节钙浓度和释放胶质递质调节脑部血流及神经元之间的物质代谢，参与了神经循环的形成[51-53]。星形胶质细胞在脑部损伤、缺血、感染和肿瘤等作用下能被活化，以保护正常脑组织[54-55]。星形胶质细胞通过旁分泌和间隙连接作用上调黑色素瘤和乳腺癌的脑转移瘤细胞的生存基因，并提高肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[6,56-58]。在胶质瘤微环境中，肿瘤周围的星形胶质细胞被激活，Cx43表达上调[13]。在体外将星形胶质细胞与胶质瘤细胞共培养模拟胶质瘤微环境，Yang等[59]发现胶质瘤对替莫唑胺敏感性降低，进一步研究发现Cx43介导的间隙连接降低了胶质瘤对替莫唑胺的敏感性，给予CBX后胶质瘤恢复对替莫唑胺的敏感性，同时RNA微阵列分析的结果显示，共培养后胶质瘤与星形胶质细胞形成间隙连接，导致其中一些耐药基因上调，抗凋亡基因下调[60]。胶质瘤细胞中Ca2+浓度也是影响其耐药的重要原因[61]，星形胶质细胞通过与胶质瘤形成间隙连接，降低胶质瘤中Ca2+浓度，减少替莫唑胺引起的凋亡[62]。此外，microRNA也可通过间隙连接通道在星形胶质细胞和胶质瘤细胞间传递[63]，这可能也是影响胶质瘤耐药的重要原因。

除星形胶质细胞外，小胶质细胞和免疫细胞等与胶质瘤通过间隙连接相互作用的现象也逐渐被揭示[64-67]，但少有关于替莫唑胺耐药的研究，周围细胞介导胶质瘤替莫唑胺耐药的分子机制还需进一步研究。

4 以Cx43为靶点的抗肿瘤候选化合物

Cx43在胶质瘤替莫唑胺耐药中发挥重要作用，但从治疗的角度来看，因其在全身表达，同时也是胶质细胞转运代谢废物、传递信号，确保心脏细胞收缩同步的重要蛋白，使其成为一个极有挑战性的药理靶点。CBX是目前研究中使用较多的间隙连接抑制剂，但由于其不能透过血-脑脊液屏障[68]，限制了其在临床上的使用。随着药物研究的深入，发现了一些临床使用的药物能透过血-脑脊液屏障并有一定的间隙连接抑制作用，如托那博沙(tonabersat)、甲氯灭酸钠(meclofenamate)等，动物体内实验结果也显示这些药物能显著增强化疗药物的治疗效果[6]，这也为老药新用提供了研究思路。近年来，Cx43的结构逐渐被解析出来，一些特异性作用于Cx43蛋白结构的抑制剂逐渐被发现。研究人员用聚乙二醇化脂质体包装重组单抗作用于Cx43的胞外域，发现其在动物体内实验中抑制了胶质瘤生长[69-70]。Cx43的C末端也是其发挥功能的重要区域，可与c-Src、PKC、AKT和AMPK等信号分子相互作用[71]，调节其通道功能和亚细胞定位等，并引发替莫唑胺耐药[72]，运用αCT1肽模拟Cx43的C末端在体内外均能显著提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性[48]。Cx43的胞内环也与其通道功能密切相关，运用L2和Gap19等模拟肽均能抑制其通道活性并减少胶质瘤与星形胶质细胞间的物质交换[73-74]。此外，许多天然药物也能非特异性的调节间隙连接，可抑制肿瘤细胞增殖并增强抗肿瘤药物的活性，如表1所示。天然药物以其不良反应小的特点著称，若对其结构进行改造增强其透过血-脑脊液屏障能力、改善脑部分布，天然药物有望成为一类逆转胶质瘤替莫唑胺耐药的重要药物。

Table1 Natural anti-tumor compounds targeting Cx43

NameTumorReferenceTotal Flavonoids of Litsea core-anaTesticular cancer[75]TretinoinProstate cancer[76]BaicaleinCervical cancer[77]QuercetinBreast cancer[78]QuinolinesBreast cancer[79]

5 总 结

近年来胶质瘤替莫唑胺耐药的研究有了很大进展，而其中Cx43介导耐药的作用也逐渐被揭示。但胶质瘤的发生发展以及肿瘤微环境的复杂性，使耐药性的发生并不仅受某种单一因素调控，具体的发生机制还需要进一步深入研究，如小胶质或肿瘤相关巨噬细胞通过间隙连接通道与胶质瘤相互作用介导耐药的机制以及以Cx43为靶点的药物研究和优化等，这些成果有望为胶质瘤临床治疗提供新的理论依据以及候选治疗药物。