基层兽医实验室检测技术的运用研究进展

温 蕾，欧阳伟强，徐淦洪，袁镜乐，陈桂霞

（1.广东省东莞市厚街镇农业技术服务中心，广东 东莞 523960；2.东莞市万江农业技术服务中心，广东 东莞 523050）

近年来，随着现代兽医学的发展，动物产业化迅速扩张，人们对食品安全要求逐渐提高，实验室检测在兽医诊断工作中越发重要。自上世纪90年代始，我国开始重视基层兽医实验室的建设，除了提升动物临床诊断外，还大力推动血清学检测技术、病源微生物的分离培养鉴定技术和以显微镜为主要设备的尿、粪、分泌物染色涂片检查。它通过生物、微生物、血清学、物理化学等检测以确定动物病情、疫情，在动物免疫效果判断、疾病诊断治疗、流行病学监测等方面应用广泛。目前，兽医实验室检测技术常见的是血清学实验和分子生物学检测技术。

1 血清学实验

血清学诊断是兽医实验室用于疫病诊断和检疫的最常见方法，它利用抗原抗体特异性结合的免疫学反应原理进行诊断。根据反应现象或原理的不同，分为中和试验、凝集试验(包括血凝及血凝抑制试验、间接血凝试验、协同凝集试验等)、沉淀试验、溶细胞试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光层析技术等。

1.1 血凝试验或血凝抑制试验

血凝试验或血凝抑制试验应用广，可检测抗原及抗体，即能有效监测动物免疫效果和检测疫病情况。血凝试验通常用于禽流感、新城疫、猪瘟、弓形虫病、口蹄疫等的实验室初筛，虽没有ELISA试验精确，却因操作简单、成本低廉、设备简易、可测样品广泛、检测出结果迅速等优点受到基层实验室的亲睐。它的缺点是试验判读都依赖人肉眼主观，受试剂、环境、人员因素影响大。

1.2 ELISA试验

酶联免疫吸附试验（ELISA试验）是国内外常用的抗原抗体实验室检测方法，操作快速简便，适用于大批量样品时的初筛定性，但是试剂盒较贵，对环境要求高，操作不当易出现假阳性和假阴性，是介于传统的血凝或血凝抑制试验和荧光PCR定量之间的性价比较高的一种方法，在养殖场的免疫情况调查、病原体检测中运用较广。

2 分子生物学检测

分子生物学检测方法在兽医实验室主要是聚合酶链式反应（PCR），是通过设计引物，经PCR扩增放大特定的遗传物质片段，以确定微量病原体种类的技术。PCR根据功能不同分为鉴定PCR和定量PCR，根据扩增模版、引物和方向等要素不同分为普通PCR、反转录PCR，反向PCR，不对称PCR，重组PCR等。现用得最多的是实时荧光定量PCR，通过在反应中加入探针或染料，扩增时检测荧光信号的变化对核酸进行定量。其优点是检测简便快速、结果准确、重复性和重现性好，特异性强，灵敏度高，有利于疾病的早发现。此外，PCR技术检测样品很广，能够实现绝大部分的DNA和RNA样本的定性和定量分析；还能通过复合PCR技术检测同一病原体的分型或同时检测多种病原体、多个点的基因突变。

在兽医实验室，PCR技术已经用于兽医卫生监督的各个方面：如监测各种疫病源头，检测各种动物疾病或流感病毒、鉴定分析病毒突变亚型、鉴定致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等微生物菌株，进行流行病学调查，协助免疫缺陷性相关疾病诊断。例如，东莞市疫病防治中心采用荧光PCR技术监测禽流感、新城疫、猪瘟、弓形虫等疫病，从核酸提取到出结果仅需3h，且自动化仪器收集荧光信号避免了肉眼判断的主观性，检测高效客观、灵敏准确，同时荧光PCR技术全封闭反应无须PCR后处理,减少污染，保证了结果的可靠性和重复性，适合大规模的动物疫病监测。

目前，随着生物芯片与荧光PCR定量技术的结合及大力发展，实时荧光定量PCR在疾病和基因诊断中的优势明显，得到各个领域广泛推广。但同时它也需注意以下问题：（1）地区实验室间标准品、参照物的选择统一性问题；（2）探针、染料试剂、仪器设备、实验室基建成本高的问题。（3）基层机构人员技术培训问题等。

总之，实验室检测在疫病防控中的地位日益突出。抗体检测可以评估种群健康状况、预防发病，帮助选择合适的疫苗，确定疫苗首免时间，同时对疫病的监控作用，确定混合感染中病毒病的范围；而病源的检测、细菌分离、鉴定和药敏实验可有效治疗和防控疫病。同时，实验室检测还需结合一线临床分析得出结论，综合考虑，充分解决现实问题，发挥出实验室最大效用。