浓缩生长因子研究进展及其对犬猫疾病治疗的作用

纪婷，赵天旭，夏楠，饶宇腾，高蕊，李婕，陈武

（1.北京农学院兽医学中医药北京市重点实验室，北京 102206；2.宠福鑫中西结合国际动物诊疗中心，北京102206；3.北京圣铭宬科贸有限公司公司，北京 100012）

1 进展

1984年，Assoion等人提取人血浆中的富血小板血浆（Platelet.rich plasma，PRP），发现其中含有多种生长因子：血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、骨形成蛋白（BMPs）、血管内皮生长因子（VEGF）、类胰岛素生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）以及成纤维细胞生长因子 （FGF）等[1]，PRP即为第一代血小板浓缩物。但是，PRP的缺点是需要在牛凝血酶的作用下才能释放出其中的生长因子，发挥其功能；而且释放生长因子的持续作用时间短，对促进组织再生修复持续时间也相应较短[2]。

第二代的血小板浓缩物（Plasma-rich growth factors，PRF），是由Choukroun首次提出[3]。抽取患者的新鲜血液，经离心机离心分离制备得到粘稠状富纤维蛋白凝胶。在此过程中，血小板被激活，同时释放大量生长因子，从而起到止血和消炎的作用，更重要的是，可促进组织愈合及血管的生成。PRF与PRP相比较，PRF释放生长因子的持续作用时间长，制备简便，具有较强的抗拉力和撕扯能力，已广泛地应用于口腔医学领域[3]。

第三代血小板浓缩物（Concentrated growth factors，CGF），是由Sacco于2006年首先介绍[4]，是用特殊的离心机将静脉血进行离心制备而来，无需加入添加剂，避免了异种抗原引起的潜在风险。与PRF相比，离心速度不同。CGF中的纤维蛋白凝块更大更密集，在移植后其释放生长因子的持续时间为7 d，生长因子更丰富，显示了更好的再生性能和更多的功能性。对于临床而言，其拥有更高的拉伸强度、粘合强度、抗凝血时间等。CGF具有可膜制性，通过压缩可以表现为薄膜的形式，CGF凝胶压制成膜后具有覆盖、保护、屏障和促进愈合的作用，从而可以粘附于缺损区，因此可以促进软组织及骨组织缺损区的组织愈合。已有研究表明，其在提高骨组织修复方面的效果令人满意，并且能够促进软组织快速愈合，减少术后瘢痕形成[5]。在临床中CGF可在种植、上颌窦提升、软组织缺损、美容等方面应用，CGF在临床上的使用形式多种多样，如凝胶状、膜状、液体状等[6]。对前两代血液提取物富血小板血浆和富血小板纤维蛋白的研究发现，其促进组织缺损修复的作用主要依赖于其内含有的大量血小板生长因子、白细胞和纤维蛋白。对于PRP和富血小板纤维蛋白的超微结构已有文献报道，但尚未发现对CGF的超微结构的研究报道。

2 CGF的制备、生物学特性及其作用特点

CGF的制备是由意大利塞法登特（Silfradent）公司继第一代血小板富集血浆-PRP（platelet-rich plasma）后，研发出提取新一代浓缩生长因子的组织修复系统。

将患者的静脉血放于Medifuge离心加速器（Silfradent，Italy）的转筒中，设定制备CGF程序，即可得到CGF纤维网状蛋白凝胶支架。其分为3层，最上层为血清，底层为红细胞及血小板，中间纤维蛋白层即为CGF被分离出来存放于稀释的抗菌溶液中，底层部分可以与混合生物材料及自体骨混合，用作填料。CGF单独或与骨替代材料混合，放于缺损组织处，可以促进骨组织成骨，软组织愈合[2]。制备过程中，由于特殊的变速离心使血小板激活，从而释放出组织再生所需的各种生长因子：PDGF、TGF-β、BMPs、VEGF、IGF、EGF以及FGF等[7]。

血小板衍生物来源于自体血，避免了免疫排异反应，从根本上解决了疾病传染的发生及移植成功率低的现状，含有多种生长因子，集合了多种生长因子的多种作用，又可以发挥相互之间的相互作用，从而促进组织再生，伤口愈合，发挥抗感染能力。在临床上CGF可以依据不同需求以膜状、凝胶状、液体状的形式使用，且不用加入任何催化成分，更加简便、安全，更适用于临床的应用[8]。

3 CGF的质量保障及检测方法与技术

Medifuge离心加速机制备出的浓缩生长因子，可用酶联免疫试剂盒测定CGF中含有TGF-β1、IGF-1、VEGF-A、PDGF-BB、FGF、BMPs-2、EGF和骨保护素等活性因子[9]。陈飞等[10]经过实验研究制备1 d后TGF-β1和VEGF在CGF凝胶层析出液中的浓度分别约为其在上清层浓度的2.67倍和1.8倍，表明离心作用有效地使TGF-β1等生长因子浓缩在凝胶层。王天祥等[7]通过使用双抗体夹心ABC-ELISA法测定静脉血、CGF中VEGF、TGF-β1等的浓度，且CGF与静脉血相比之下，CGF中VEGF的含量增加了（21.90±2.44）倍，TGF-β1的含量增加了（7.59±2.03）倍，此实验结果说明浓缩生长因子具有纯化且提高血液中VEGF、TGF-β1等生长因子浓度的作用，使CGF中含有高浓度生长因子，进一步发挥其抗感染、促进骨组织形成、加速组织愈合等作用。

4 对犬猫疾病防治作用分析

4.1 角膜损伤

角膜损伤性疾病是当今世界上主要致盲性眼病之一，目前临床上导致角膜致盲较为常见的原因主要有上皮损伤和角膜内皮损伤[11]。一般疾病发生，主要治疗方式还是手术治疗：主要包括全层角膜移植手术，也称其为穿透性角膜移植术（enetrating keratoplasty，PIo）、板层角膜移植术（Lamellar keratoplasty，LPK）和角膜内皮移植术（Endothelial keratoplasty，EK）[12]。角膜移植术与其它器官移植相比，角膜移植是有着相当大的成功率。但是每年角膜供体短缺问题一直未得到有效的改善，且角膜移植存在很高排斥反应。CGF中与角膜瘢痕关系最密切的是TGF-β。TGF-β1、2、3的mRNA可在正常犬猫角膜上皮细胞和内皮细胞中检测到，TGF-β1、2的mRNA可在角膜基质细胞中检测到[13]。当角膜受到创伤后，其TGF-β1、2、3及其受体的表达增多[14]；并且角膜雾状混浊的轻重与角膜TGF-β1mRNA的强弱也密切相关[15]；TGF-β可抑制眼睛表面瘢痕的形成，将其应用到临床角膜疾病可取得一定疗效。

4.2 口腔溃疡

该疾病除哺乳犬猫外，各年龄、性别以及品种的犬猫都有可能发生，以夏季为多[16]。患病动物主要表现为无食欲，流涎，精神沉郁，不让接触，几乎不能饮食。全身治疗多是对因治疗，采用补充维生素，减少发作次数[17]。局部治疗以促进溃疡创面愈合，缓解患病动物疼痛为目的。CGF中TGF-β、VEGF、PDGF、IGF和BMPs等。这些生长因子可以提高表皮细胞的移动能力，减少瘢痕的形成，促使肉芽组织快速生长，并且能辅助中性粒细胞加强机体防御，进而促进伤口愈合[17]。CGF在慢性溃疡的治疗中有积极作用[18]。

4.3 创伤愈合

创伤愈合是表皮细胞增生覆盖创面的再上皮化和进入伤口的成纤维细胞增殖、分化和合成分泌细胞外基质的纤维化以及新生血管长入伤口的血管化等综合作用的结果[19]。CGF中PDGF对中性粒细胞、单核细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等有趋化吸引作用并使成纤维细胞受到强力刺激以致增殖及诱导其合成胶原和纤维连接蛋白等成份，以形成肉芽组织促进伤口愈合[18]；TGF-β也可以促进胶原积聚和伤口中肉芽组织形成；此外，增强胶原基因的表达可通过TGF-β与基因调节蛋白结合从而促进胶原的积聚[20]。应用外源性TGF-β可加强伤口的物理学成份提高伤口的张力和愈合率；FGF促进瘫痕形成的作用；EGF和IGF都是提高慢性皮肤伤口的愈合率和伤口愈合后的张力；VEGF刺激内皮细胞生长促进伤口的血管化进程[20]。CGF可以提供伤口早期愈合所需的多种生长因子，可以减少瘢痕形成，提高愈合质量，值得在临床上应用[21]。

4.4 皮肤病

皮肤病是发生在皮肤和附属皮肤脏器的总称。随着犬、猫伴侣动物数量的增多，皮肤病的感染也日趋增多。当发生皮肤病时，针对不同的寄生虫、真菌和细菌以及其他病菌皮肤病，一般首选抗生素类、抗真菌类和抗细菌类药物，都具有很好的疗效。有文献研究CGF中TGF-β、VEGF和IGF对皮肤病有影响。银屑病中IGF能调控钙诱导的KCs分化相关的基因表达，参与表皮分层的异常，还参与了免疫机制的异常反应[22]；银屑病患者皮损中VEGF含量较正常人显著提高，其可能是银屑病血管异常生成的重要促进因子[23]；银屑病患者表皮的过度增殖可能是由于皮损处KC逃脱了TGF-β家族的配体和受体系统的抑制作用[24]。TGF-β在硬皮病皮肤硬化和光老化发挥着重要作用。TGF-β、VEGF、IGF对皮肤肿瘤也起着重要作用。可以进一步深入研究临床上CGF对犬猫皮肤病的影响，是否可以提高疗效。

4.5 慢性骨关节炎

骨关节炎是一种退行性的临床综合征，是由多种原因造成关节软骨破坏引起的并伴有疼痛及残疾等症状的疾病[25]。发病率随着年龄的增加而增加。一般治疗方法有减肥（针对肥胖犬猫）、水疗法、理疗以及外科手术治疗。其CGF中PDGF能显著促进骨髓基质干细胞的有丝分裂进而增加成骨细胞的数量，促进移植区的毛细血管生长[26]。TGF-β可促进成骨前体细胞的有丝分裂，进而促进骨细胞的生长发育[27]。IGF也可促进成骨细胞的有丝分裂，此外还可促进皮肤骨骼及神经系统细胞的生长发育[28]。VEGF可以促进新生毛细血管形成，促进成骨细胞的分化，提高碱性磷酸酶的表达，增强血管的通透性从而促进骨折愈合[29]。

4.6 神经损伤

近年研究发现，在CGF所含有的生长因子中，IGF不仅对大脑发育有一定影响，而且可抑制细胞凋亡，对许多中枢疾病发挥着保护作用且有助于神经细胞受损后的功能恢复[30]。VEGF对神经也具有保护作用[31]。EGF与组织修复、肿瘤发生以及胚胎发育有密切关系，并且能强烈刺激细胞分裂。EGF通过与表皮生长因子受体（EGFR）高亲和力结合发挥作用，对多种中枢神经系统（CNS）受损如神经胶质瘤、视神经挤压伤和脊髓损伤等均有一定的治疗作用[32]。它可以营养髓鞘，减缓髓鞘脱失，对犬瘟热脑炎疾病有一定治疗作用[33]；促进神经干细胞（NSCs）分化为神经元，改善神经元丢失，促进CNS损伤后的功能修复。目前已经在动物模型和细胞培养中得到证实，但将这些方法应用于临床治疗仍需要进行更深入的研究。TGF-β1在中枢神经系统肿瘤、神经生长、保护、外伤及炎症等方面也发挥一定的作用[34]。这些研究为中枢系统疾病的治疗提供了新的研究方向，但目前尚未明确相关作用机制，有待进一步研究。

5 结束语

目前，国内外学者己开始将CGF纤维蛋白凝胶应用于医疗领域，如人牙周组织手术、种植外科手术、软组织整形手术以及犬猫骨折手术，骨关节炎恢复，软组织损伤愈合，角膜损伤修复中，并取得了很好的效果。由于CGF具有完全来源于自体血液，无毒性，无免疫原性，且制备简便，费用低廉，不会发生交叉感染等优点，其临床应用前景十分广阔。但是，在国内宠物（犬、猫、马）临床，CGF应用的鲜见报道，鉴于其作用及特点，我们有理由期待CGF疗法能够发挥其应有的作用，造福动物。

然而，CGF浓度是决定其作用发挥的关键因素。如何保障所制取的CGF制剂中相关生长因子的含量，除制备技术之外，自体生长因子水平的高低起决定性作用。中国传统兽医的针灸疗法具有调节机体固有机能的作用，我们的前期研究表明，电针疗法对多种神经再生相关生长因子的产生具有促进作用[35]，通过针灸干预，有望提高相关生长因子的水平，从而有助于获取更高质量的CGF，保障其作用的发挥[36]。