心脏再生治疗学的研究进展

蒋钦 综述 黄克力 张浩 胡盛寿 审校

(1.四川省医学科学院四川省人民医院心脏外科,四川成都610072；2.北京协和医学院&中国医学科学院阜外医院，北京100037)

心血管疾病已成为全球范围内的首位死因，占中国城乡居民死亡比例的40%以上。冠心病已成为中国心血管疾患的主要病种，近几年急性心肌梗死的总体死亡率仍呈上升趋势。心脏缺血损伤后通常会形成瘢痕，临床上心肌梗死后由于心脏收缩功能下降，远期多会导致心功能衰竭。心脏再生医学的目标即是心肌损伤后通过增加有活力的心肌细胞，从而恢复心脏收缩功能，方法包括外源性诱导和内源性刺激心肌再生。本综述简要总结三种促心肌损伤修复生物学方法：内源性心肌再生、干细胞移植、外源性诱导重组编程转分化。

1 内源性心肌再生

相比于其他器官，心脏明显难以再生。出生后心脏再生是否存在，这从根本上很难去求证，或是心脏再生速率非常低，以至除非使用高度敏感的方法否则很难发现[1]。切除斑马鱼20%的心室后两个月内心脏即可完全再生，再生的新生心肌主要来源于心外膜。心肌再生需要心肌细胞再次进入细胞周期，因此再生与细胞周期调控点的有丝分裂检测点激酶有关，该激酶突变后心肌损伤则不能再生而形成瘢痕[2]。成年斑马鱼心尖切除后再生电偶联心肌主要是通过表达特定转录因子的心肌细胞群的激活与扩张[3]。

出生后1 d的小鼠心肌部分切除可以再生，其特点为心肌细胞增大，伴有轻微的肥大和纤维化，这与典型的修复表现不同。再生心肌具有正常的收缩功能。基因示踪研究表明大多数再生心肌细胞源于预先存在的心肌细胞，但这种再生能力不超过7 d[4]。多同位素质谱成像示踪研究发现刚成年小鼠心脏的心肌细胞预计每年以0.76%速率生成新的心肌细胞，随着年龄增加速率降低，当心肌损伤时损伤边缘再生增加4倍[5]。由于出生后哺乳动物的心肌细胞分裂导致双核化，因而使得心肌再生的定性研究变得更加复杂，双标记镶嵌法研究显示小鼠心肌细胞在宫内时有显著的对称分裂，而出生一个月后明显下降[6]。

而在人体很难去检验心肌细胞是否是出生时的状态，还是后期新生成的心肌细胞。利用冷战时期核爆炸反应产生的C-14结合到DNA这一现象，发现心肌细胞更新速率呈递减趋势，在25岁时每年更新1%，在75岁时则下降到0.45%。由此推算人的一生中不到一半的心肌细胞发生改变[7]。心肌细胞增殖的特点：肌节去组装，具体地说，有丝分裂中肌小节结构边缘化到达细胞周边。通过免疫染色法如5-溴脱氧尿苷、Ser10磷酸化的组蛋白H3、有丝分裂驱动蛋白样蛋白、Aurora B激酶表明心肌增殖在出生后到成年这段时期发挥了重要的作用。心肌细胞胞质分裂贯穿一生，婴儿期最高，成年后不明显。在此期间，左室心肌细胞数量增加3.4倍[8]，目前发现与内源性心肌再生相关的因素如下。

1.1 缺氧

出生后的高氧含量环境被认为是心肌细胞的细胞周期停滞的上游调节信号[9]。出生后1周活性氧，DNA氧化损伤，DNA损伤反应标志物明显增加；而出生后缺氧，清除活性氧，抑制DNA损伤反应都可以延长出生后心肌细胞增殖时间窗；高氧血症和活性氧产生剂却缩短增殖时间区间。心脏存在一种保护机制介导细胞周期停滞以换取利用氧气依赖的有氧代谢，减少线粒体依赖的氧化应激是心肌细胞增殖为基础的治疗方法的重要部分。暴露在空气中的氧气导致哺乳动物心肌细胞出生后几天停止增殖，这也解释生活在低氧环境下的成年斑马鱼能够再生大部分心脏[10]。由于出生后心肌代谢从糖酵解向氧化磷酸化转换，因此强制心脏细胞使用糖酵解底物或者减少依赖三羧酸循环作为能量通路可维持心肌细胞处于增殖状态[11]。成年小鼠每天逐渐减少1%的吸氧浓度，最后保持在7%的水平两周，可以抑制线粒体氧化代谢，降低活性氧化物的生成和DNA氧化，诱导心肌细胞进入细胞周期，重新激活心肌细胞有丝分裂，左右心室增大。同样成年小鼠心肌梗死后保持低氧血状态1周也可诱导强大的再生反应，且有毛细血管管径增加，心肌纤维化降低，相对增加左室收缩功能20%；增加缺氧时间可继续增加收缩功能，而且没有导致肺动脉高压[12]。

1.2 甲状腺激素

普遍认为出生后心肌细胞的终末分化阻止了胞质分裂，继而出现双核和再生修复能力停滞，这意味着青春期心脏完全以心肌细胞肥大方式生长，但小鼠在出生后几周的时间里心脏重量增加很多倍，研究显示小鼠出生后15 d甲状腺激素的骤升激活了占主导的双核心肌细胞短暂又迅猛的增殖，这种增殖导致心肌细胞数量增加大约40%，心肌细胞增长明显超过心脏重量增加。出生后15 d的损伤反应处于出生后2 d与出生后21 d的中间状态，提示心肌细胞持续增殖能力超过围生期[13]。单独心肌细胞增大不能解释出生后10～35 d心脏重量的变化，提示这段时间T3/类胰岛素生长因子信号使成熟多核心肌细胞进入细胞周期，导致明显的细胞增殖[14]，这种与激素增长相关的心肌细胞增殖似乎为出生后心肌细胞再生找到了干预手段。

1.3 其他因素

小鼠出生后早期给予重组生长因子神经调节蛋白-1刺激可以诱导心肌细胞增生，其作用更强于直接的心脏保护作用。重组生长因子神经调节蛋白-1也可诱导小于6个月的先天性心脏病婴儿心肌细胞增生[15]。质谱分析发现心外膜细胞具有潜在心源性活动的卵泡抑素样蛋白-1。在小鼠和猪的心肌梗死模型中使用含有人卵泡抑素样蛋白-1的心外补片可以刺激心肌细胞进入细胞周期，诱导心肌细胞产生分裂增殖，提高心脏功能和存活率[16]，因此其目标机制是调节心肌细胞损伤后的细胞周期。心肌细胞过表达核基质相关DNA复制蛋白CIZ1，延长了心肌发育的增殖时间窗，延迟终末分化时间且不损伤心脏功能[17]。注射胸腺素β4也能延长新生小鼠心肌细胞再生的时间区间[18]。调节心肌细胞周期的研究仍在继续，除了上述因素，一些信号通路如丝裂原活化蛋白激酶、丝/苏氨酸蛋白激酶通路等也是调节细胞周期的节点[19]。

2 干细胞移植治疗

可移植的外源性干细胞主要包括循环祖细胞[20]或者心脏干细胞[21]、骨髓干细胞[22]、诱导多能干细胞或胚胎干细胞等种类，后两者转化为纯化的心肌细胞很难并且有致瘤风险[23]。通过冠状动脉旁路移植术中桥血管注入自体骨髓单个核细胞治疗陈旧性心肌梗死合并慢性心力衰竭患者，研究发现相比于对照安慰剂组，细胞移植组增加心脏收缩功能，改善运动耐量[24]。不同于传统的细胞预处理方式，远程缺血性适应修饰移植受体改善细胞移植的治疗效率也取得显著效果，其作用机制包括增加心肌的募集干细胞作用[25]，改善细胞移植的微环境[26]，改变移植细胞在体内脏器中的分布比例[27]。当前干细胞移植研究多倾向于细胞移植的旁分泌作用机制[28]；但新近动物实验研究发现自体间质干细胞联合心脏干细胞移植有助于心肌细胞再生[29]。如今骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭已进入关键的临床Ⅲ期试验，成功的临床试验结果有助于推动干细胞移植治疗成为一种新的再生医学生物治疗模式[30]。

3 细胞直接重编程

在2006年日本学者里程碑式发现体细胞过表达一组转录因子后转分化为诱导多能干细胞。研究者由此得以启示开始寻求不通过多能干细胞中间状态，而是将成纤维细胞直接重编程为有功能的心肌细胞的最佳策略[31]。包括使用不同的重组因子、微小RNA[32]、小分子[33]和介质，这些策略在体外均被证实，但却只是取得一些微小的成果。至今仍没有在人和鼠中发现强力的方法或组合可以有效地将各种成纤维细胞转分化为真正成熟、完全有功能的心肌细胞。如何通过提高重编程效率比如添加小分子辅助的化学修饰也被证实有效[34]。体内重新编程方法相比于干细胞移植有几个优点，重组编程因子直接注入心脏，免去了细胞移植相关的归巢、存活、迁移等相关问题，没有了分化前的多能诱导状态降低了心脏肿瘤形成风险。由于大多数心脏病伴有心脏纤维化增加，因此理论上这种方法可用于伴有纤维化增加的各种心脏疾病。

总的来说，近来发现曾经认为终末分化器官的心脏是一个动态更替变化的器官。哺乳动物成年后心脏具有有限但仍可发现的内源性自发再生能力，在正常衰老过程中，既存的心肌细胞是新生的心肌细胞的主要来源。由于大多数心脏病存在心肌细胞丢失，损伤后必然需要修复方法治疗心肌收缩功能下降。当前，心肌梗死治疗主要集中在再灌注损伤治疗和减轻心室重构方面，而针对于补充丢失心肌细胞的治疗策略还没有进入临床。尽管干细胞移植在基础研究取得可喜的成绩，也是最有可能在临床上开展应用的治疗项目，但临床治疗效果还远远不如基础研究所达到的治疗效果。研究出有临床意义的增加内源性再生策略或者体内细胞转分化治疗方兴未艾，虽然理念上更加积极先进，但前进的步伐仍然举步维艰。