心房颤动相关的循环微小RNA

余琳 综述 张进 范洁 审校

(1.昆明理工大学，云南昆明650550；2.云南省第一人民医院，云南昆明650032)

1 心房颤动与微小RNA

心房颤动(atrial fibrillation，Af)是临床常见的心律失常，当电生理异常改变心房组织时，促进异常电脉冲的形成或传播，这是最常见的心律失常类型，是一个重大的健康、社会和经济问题，尤其是在老年人中，增加卒中、心力衰竭的发病和残疾的风险[1]。Af诊断方法包括心电图和脉搏监测，然而，在早期阶段，由于缺乏明显的症状或持续时间短，Af难以诊断。虽然动态心电监测24 h甚至7 d有助于Af的检测，但仍无法评估无症状患者的初始Af期。因此，有必要寻找新的可靠的生物标志物来早期诊断和监测这种疾病。心房的电重塑和结构重塑会引起Af的发生和维持状态的改变，可能与调节分子(如非编码RNA)和涉及心房生理学的蛋白质编码基因介导的基因调节有关[2]。微小RNA(microRNA/miRNA)是具有约22个核苷酸的内源非编码RNA，通过在转录后水平与靶mRNA进行碱基配对而发挥重要的基因调控作用[3]。 miRNA介导的基因表达抑制的机制涉及mRNA降解或mRNA翻译的阻断。此外，有的miRNA具有致心律失常的潜能，不同的miRNA涉及不同类型的Af[4]。然而，循环miRNA作为诊断Af的标志物的作用尚未确定。 miRNA在心血管系统中的突出作用为疾病机制提供了新的视角，并揭示出用于各种心血管疾病有价值的诊断和治疗靶点。最近，这些分子作为潜在的非侵入性生物标志物，如Af在生物流体中被检测到并且高度稳定[5]。本文旨在提供循环miRNA在Af中作用的概述，并讨论miRNA作为心脏疾病生物标志物的诊断潜力。

2 参与Af血浆中的miRNA

miR-146a、miR-150、miR-19a和miR-375在第一个评估Af中循环miRNA的研究中显著下调，其中miR-150表现出的变化更明显，表明其与Af有潜在的关联性[6]。作者首先进行了一次筛选，以确定血浆中的候选miRNA以及进一步研究。Liu等[6]利用大规模平行测序来分析比较阵发性心房颤动(paroxysmal atrial fibrillation,PAf)患者(n=5)、健康个体(n=5)以及持续性心房颤动(PersAf)患者(n=5)血浆中的miRNA表达谱。在PAf组中检测到243个miRNA，在PersAf组中检测到256个miRNA。miR-125a-5p、miR-19a、miR-221、miR-421、miR-342-3p和miR-409-3p在PAf患者中上调但在PersAf患者中不上调。此外，10个特定的miRNA(miR-146a、miR-589、miR-146b-5p、miR-100、miR-150、miR-199a-5p、miR-199b-5p、miR-375、miR-99b和miR -320b)在PAf和对照组之间表达水平有差异，而在PersAf中则是11个(miR-146a、miR-148b、miR-19a、miR-221、miR-421、miR-598、miR-941、miR-100、miR-150、miR-320b和miR-375)。接着，团队对以上miRNA进行验证，通过使用试剂盒分离总RNA(30例健康个体，30例PAf患者和30例PersAf患者)后进行即时定量聚合酶连锁反应(qRT-PCR)，只有4个miRNAs(miRNA-146a、miRNA-150、miRNA-19a和miRNA-375)通过评估，在血浆中有差异表达。

在2013年，Dawson等[7]证实，Af或充血性心力衰竭(CHF)患者的血浆中的miR-29b和miR-21表达显著下降，而对照组和CHF患者的miR-29b水平甚至更低。CHF引起纤维性Af重建并有助于Af的维持。因此，miR-29b和miR-21可能是心房重构的重要生物标志物。在这项调查中，通过qRT-PCR确定候选miRNA在血浆中的水平，研究组由患Af患者17例、患CHF但无Af患者32例、患Af和CHF患者16例、对照组30例组成。

同年，Nishi等[8]认为，miR-21可能参与了Af的发生，因为与窦性心律患者相比，Af患者的心房组织中miR-21高表达。 另一项研究还通过qRT-PCR对比了16例Af患者与4例健康志愿者的miR-21在血浆中的表达水平，旨在确定是否会获得相同模式的差异表达。令人惊奇的是，Af患者的miRNA-21血浆水平显著下降，揭示了miRNA-21在心房组织和血浆中的表达水平之间的反比关系。

Lu等[9]研究了血浆miRNA表达谱的变化以及与Af相关的miRNA在离子通道上的调节作用。研究其中包括112例Af患者和112例非Af患者作为对照，利用芯片(miRCURY LNA芯片)分析血浆混合液中的miRNA表达谱。Af患者与对照组相比有15种miRNA表达明显不同，结果显示miR-328、miR-145、miR-222、miR-1、miR-162、miR-432和miR-493b的表达下调，miR-634、miR-664、miR-9、miR-152、miR-19、miR-454、miR-146和miR-374a表达上调。

一项研究[1]评估局部和全身血浆中miRNA的表达水平及其与Af和左心房底物特性的关系，揭示了miR-328在Af患者心房重构过程中重要的潜在作用。收集肺静脉隔离Af患者(n=30)的肺静脉和左心耳，其中阵发性Af患者(n=20)、持续性Af患者(n=10)，以及帕金森综合征的患者(n=10)作对照组。通过qRT-PCR确定miR-1、miR-26、miR-133a、miR-328和miR-590血浆中的水平。这项研究表明，Af患者心房内miR-328的局部产生可能与其心房重构的过程有关，因为Af患者的血浆miR-328水平高于对照组，且在Af患者左心房血浆中的miR-328明显较外周和肺静脉高。另外，Af患者左心耳的miR-1表达水平也高于肺静脉中。

Mcmanus等[10]在一项包括Af患者(n=112)的研究中，发现循环miR-21和miR-150与Af相关，与没有Af的患者(n=99)相比，该研究通过使用BioMark系统的qRT-PCR评估了在公共数据库中选择的与心房重塑或Af的发病机制有关的86种miRNA的血浆水平。 Af患者的血浆miR-21和miR-150显著低于无Af患者。

另一项[11]旨在揭示循环miRNA作为Af相关生物标志物的研究则是由PAf患者(n=88)、PersAf(n=8)、长期持续性Af 4例、健康人(n=100)组成。这项调查使用Solexa测序检查射频导管消融患者血浆中Af特异性miRNA的水平，总共显示了在Af组和对照组中分别检测到389和517个miRNA。在Af组中发现5个miRNA(miR-454、miR-374a、miR-9、miR-152和miR-664)表达上调，而11个miRNA(miR-874、miR-486-5p、miR- 328、miR-338-5p、miR-766、miR-409-3p、miR-16-2、miR-487b、miR-493、miR-432和miR-4732-3p)表达下调。通过使用qRT-PCR方法对16个候选miRNA进行了两个样本库对比检测，结果显示miR-432、miR-409-3p和miR-328在Af组中表达下调，这与测序结果相似。研究者表示其他13个miRNA与测序不一致结果或动态趋势不明显。

一项最新研究[12]表示，在矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2,SHOX2)基因中3’端非翻译区位点(3’UTR)中出现了单核苷酸多态性，进而产生了新的miR-92b-5p靶位点。曾一度有文章认为，SHOX2是一种可能引起心律失常的易感基因，作者认为在携带3’UTR变异体的个体中，miR-92b-5p的表达可能引起心律失常性，导致Af的发生。为了调查miR-92b-5p在循环中的表达水平是否反映了这种情况，作者对23例Af患者和12例窦性心律患者中miR-92b-5p的血浆表达水平进行qRT-PCR。并没有发现这些群体之间存在显著差异；然而，他们发现携带3’UTR变异的Af患者显著降低了血浆中miR-92b-5p的表达水平，Af患者中则没有发现这种多态性。

3 参与Af的血清miRNA

一项研究[13]使用qRT-PCR分析研究miR-126在心力衰竭(HF)和Af患者血清中的关联，研究组由Af组(n=35)、HF组(n=32)和HF-Af组(n=36)与对照组(n=32)比较。与对照组相比，3个患者组中的miR-126下调，但HF-Af组显著低于其他组。考虑到Af可能与HF的严重程度有关，Af、HF和HF-Af患者血清miR-126表达水平较低，特别是HF患者尤其如此，作者认为miRNA可以作为评估Af和HF严重程度的潜在候选生物标志物。接受冠状动脉搭桥手术的患者可以引起Af，为术后Af,Harling团队评估了循环miRNA作为Af术前生物标志物的潜力。他们通过使用芯片评估miRNA的表达，与维持窦性心律的患者(n=11)相比，有16个 miRNAs在术后Af患者的心房肌中差异表达。选择了候选miRNA(miR-483-5p和miR-208a)在13例经Af术后Af患者血清和21例未经Af术后Af患者血清中进行qRT-PCR检测，分别于术前24 h、术后48 h和术后96 h的不同时间点进行。在任何时间点均未检测到miR-208a，并且miR-483-5p术前显著较高，但在48 h或96 h不高。因此，验证的循环miR-483-5p对于确定该生物标志物用于评价术后Af的可靠性是必要的。

4 参与Af的血小板miRNA

已有研究显示miRNA参与血小板功能、血管稳态和炎症。此外，循环中血小板miRNA的水平与心血管疾病的风险相关，提示血小板衍生的miRNA与心血管疾病相关联，可以作为预后或治疗的生物标志物发挥重要作用[14]。计算机模拟研究表明，血小板中miRNA及其外周血细胞中靶miRNA的差异表达可能与血小板的变异反应性、药物反应和药物引起的毒性有关。已有文献[15]证明血小板是miRNA脱落的关键因素，血小板对循环miRNA特征有显著影响，而且许多循环miRNA的水平与血小板活化直接相关，这些miRNA调节细胞内的miRNA翻译，并且可以传递给内皮细胞，影响它们的功能。一项研究[16]通过qRT-PCR评估了41例HF患者中血小板衍生的miRNA水平，15例同时存在HF和Af患者，26例HF患者，35例对照组。与HF的患者相比，HF-Af患者的血小板中miR-150水平降低了3.2倍。而HF-Af组及对照组对比观察中，其miR-150水平在HF-Af患者中仅降低1.5倍。因此，miR-150在HF-Af患者血小板中的表达水平明显减少与该miRNA的无细胞循环水平相关。

5 参与Af的全血miRNA

为验证[17]miR-328与Af的发生是否相关联，使用高通量qRT-PCR平台BioMark动态阵列，在153例Af患者和2 185例无Af患者中进行了385个miRNA表达分析。结果显示，与无Af的患者相比，有Af的患者miR-328表达显著降低，在这项研究中，只有miR-328与风险因素、RNA质量和浓度的调整有显著相关。

6 展望

在过去几年中，miRNA在生物体体液(如血液中)的研究因其在样本中的稳定性和广泛的生物学潜力而迅速扩大，成为各种疾病的无创生物标志物中强有力的候选者，包括Af[18]。选择的12项研究中，血浆8项、血清2项、血小板1项、全血1项；但是，没有找到关于循环的外泌体的深入研究，它含有RNA、miRNA和蛋白质，对细胞间通讯至关重要，是重要的细胞外囊泡[19]。

在本文中，观察到与Af相关的多种miRNAs，以及不同研究结果的差异。在所有研究中观察到的miRNA不统一可能与不同类型的样品有关(血浆、血清、血小板和全血)以及使用的分析方法，研究中每个人群的内在多样性也可能影响结果[20-22]。 17个miRNA被认为是作为Af的生物标志物最好的候选者，发现只有3个miRNA(miR-21，miR-150和miR-328)在多个研究中下调，表明它们可能在Af发展中具有重要作用。值得注意的是，在使用血浆的三项不同研究中，miR-21是唯一明显降低表达水平的研究，这些研究巧合地观察到患者中的这种表达特征与PersAf的发生相关联。因此，miR-21可能成为这类Af的强生物标志物。

通过对以上研究的观察，发现关于HF 与Af之间关系的研究现已广泛开展,HF在Af维持和发展中扮演了重要角色已成为主流观点。左心房在维持HF心血管稳态中发挥重要作用，其引起结构和电变化，导致Af的发生[23]。

此外，以上研究具有一定的局限性，样本量从13例到153例不等，导致与Af相关的miRNA出现多样性，加之用于分析结果的统计学方法，可能导致某些小样本群体中较少丰度的miRNA未被发现。所以，对于样本量较大的Af患者循环miRNA水平的评估可能会产生更可靠且相容的结果。

总之，未来的研究将有必要确定可靠的循环miRNA作为早期诊断、监测以及Af治疗的生物标志物，使用类似和详细的衡量标准来避免研究中检测到的miRNA的变异性。这需要通过更多的实验来实现。准备优化的miRNA评估方案将有助于提高结果的可靠性和可重复性，这在考虑这些分子的临床应用时非常重要。