钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在心律失常中作用的研究进展

何蕊 综述 李为民,2 审校

(1.哈尔滨医科大学附属第一医院心内科，黑龙江哈尔滨150001；2.哈尔滨市第一医院心内科，黑龙江哈尔滨150010)

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)具有多重作用，它可以磷酸化许多蛋白质，包括L型钙通道、兰尼碱受体(ryanodine receptor，RyR2)、电压门控Na+通道和K+通道、ATP敏感的K+通道和氯离子通道等，这些蛋白质对心律失常至关重要。并且细胞内离子处理异常是心脏病理学中CaMKⅡ功能障碍的标志。因此，影响CaMKⅡ的表达或活性是一种有前景的策略，可用于预防心律失常。

1 CaMKⅡ的分子结构和亚型

1.1 CaMKⅡ的分子结构

CaMKⅡ是一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有广泛的蛋白质底物和广泛的组织分布。每个CaMKⅡ单体由三个区域组成，包括氨基端催化区、中间调控区和羧基端链接区。催化区负责激酶的活性，基础状态下与调控区相互作用而自动抑制。调控区包含Ca2+/钙调蛋白结合区以及多个调控位点。这些调控位点对自动磷酸化(苏氨酸Thr287-CaMKⅡδ中调控位点的残基编号)、氧化(蛋氨酸Met281/282)和O-连接的糖基化(丝氨酸Ser280)作出应答，产生特有的活化状态[1]。链接区负责十二聚体全酶的组装，它参与多聚化过程，形成具有两个六聚体叠加环的成熟十二聚体全酶。Ca2+/钙调蛋白与激酶调控区的特定部位结合，使其对催化区的自动抑制作用解除，这赋予了激酶主要的活化状态，同时也暴露了多个调控位点，促使激酶进入依赖环境的替代激活模式。

1.2 CaMKⅡ的亚型及定位

目前存在四种主要的基因表型，即α、β、γ和δ，由4个独立基因编码，心脏主要表达δ亚型，也表达γ亚型。mRNA的可变剪接增加了CaMKⅡ亚型功能和/或定位的多样性。在成人心肌中，CaMKⅡδ主要表达两种剪接变体：CaMKⅡδB和CaMKⅡδC。CaMKⅡδB包含一个由11个氨基酸组成的核定位信号，核定位信号调控CaMKⅡδB优先核定位。剪接变体CaMKⅡδC仅缺少这种核定位信号而优先定位在细胞质中。大多数CaMKⅡ的亚型易形成稳定的异源寡聚体，因此多聚体中δB与δC的比率可以调节全酶的定位；但是即使仅表达一种剪接变体(CaMKⅡδB或CaMKⅡδC)，并不代表细胞核中仅存在CaMKⅡδB或细胞质中仅存在CaMKⅡδC。CaMKⅡδB的相对表达可在体外通过磷酸化/去磷酸化进程发生改变，在不同的生理和病理条件下进行修饰，证实CaMKⅡδ的剪接是一个高度调控的动态过程[2]。

2 CaMKⅡ的激活机制

2.1 Ca2+/钙调素依赖性CaMKⅡ激活

在CaMKⅡ失活状态下，调控区的假底物区通过空间上阻断底物与腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)结合区结合[3]来抑制每个CaMKⅡ亚基的催化区。随着细胞内Ca2+增加，Ca2+与钙调素(calmodulin，CaM)结合形成钙化CaM(Ca2+/CaM)，与调控区的羧基端结合激活CaMKⅡ。这引起假底物区构象发生改变，抑制作用解除，底物和ATP进入催化区，从而激活CaMKⅡ。

2.2 非Ca2+/CaM依赖性CaMKⅡ激活

在存在ATP的情况下，Ca2+/CaM的持续增加会使调控区中自身抑制区的Thr287位点自身磷酸化。自身磷酸化促使构象发生改变，阻止催化区和调控区相关联，导致持续的Ca2+非依赖性激活。Met281/282位点的一对蛋氨酸残基产生与自身磷酸化类似形式的持续的Ca2+/CaM非依赖性激活。其他引起CaMKⅡ自动激活的翻译后修饰还包括通过O-连接的N-乙酰葡萄糖胺[4]介导的Ser280位点的O-连接的糖基化和假定的116、273或290位点半胱氨酸残基的NO-依赖性亚硝基化作用。

研究发现，Thr306/307位点磷酸化会减少与Ca2+/CaM复合物的结合，导致CaMKⅡ失活。自身抑制区外Ser273位点NO修饰会使CaMKⅡ失活。因此，CaMKⅡ可通过翻译后修饰激活或失活。但在上游信号提高细胞内Ca2+和活性氧(reactive oxygen species，ROS)浓度的影响下，对CaMKⅡ自身抑制区的翻译后修饰可作为一条CaMKⅡ持续激活的途径[1]。CaMKⅡ可以转导多种上游信使，这提出了“中枢机制”存在的问题，这种机制与蛋白激酶A(proteinkinase A，PKA)信号通路类似，并可以调控CaMKⅡ的激活。然而这种中枢机制并不存在。即使在生理(舒张)细胞内Ca2+存在的情况下[5]，增加的ROS也可引起Ca2+/CaM非依赖性激活。此外，与PKA相似，β肾上腺素能刺激也可以通过cAMP-Epac通路激活CaMKⅡ。全细胞的改变例如兴奋-收缩偶联和局部Ca2+的改变可以激活CaMKⅡ。

3 CaMKⅡ相关致心律失常的机制

除动作电位(action potential，AP)第一阶段的生理性去极化之外，在AP第二阶段和第三阶段发生病理性早期后除极(early afterdepolarizations，EADs)。并且在细胞完全复极(AP的第四阶段)后，可发生延迟后除极(delayed afterdepolarizations，DADs)。如果EAD或DAD达到AP发生的膜电位阈值，则会引起足以导致心律失常的触发活动。

CaMKⅡ作用于RyR2的S2814位点使RyR2过度磷酸化，导致肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)自发的基本Ca2+释放活动显著增强(Ca2+泄漏)，特别是在舒张期[6]。心肌SR Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)生理性地将泄漏的Ca2+摄取回SR，特别是在受磷蛋白(phospholamban，PLN)被CaMKⅡ依赖性磷酸化时，SERCA摄取Ca2+的作用增强。然而在病理条件下，SR过多地泄漏Ca2+到细胞质中，使舒张期细胞质中Ca2+浓度升高，激活钠钙离子交换体蛋白(Na+/Ca2+exchanger，NCX)交换电流，产生DADs。

CaMKⅡ过度激活引起Na+电流增加，L型Ca2+电流增加或K+通道功能受损(意味着膜复极速度减慢，复极储备减少)，并通过这三种机制延长复极。如果复极时间延长得足够长，内向流动的通道(如早期INa)可以从不应期中恢复，此时膜仍处于去极化期，可以再次过早激活，从而引发EADs。

上述CaMKⅡ的致心律失常作用除了能诱发心律失常之外，还可提供一种通过其他机制使心肌更易诱发心律不齐的底物，例如降低RyR2不应性导致QT间期变化，使心脏易于发生Ca2+触发的心律失常[7]。

4 CaMKⅡ的抑制剂

广泛用于研究的CaMKⅡ抑制剂是KN-93和AIP。KN-93是一种变构的且CaM竞争性的CaMKⅡ抑制剂，它也可以直接抑制钾电流(IKr)和其他电压门控钾通道，使其抗心律失常特性的评估复杂化。KN-93还可以直接抑制L型钙通道。AIP是一种底物竞争性肽抑制剂，但也产生一些与CaMKⅡ抑制无关的效应[8]，由于它的膜通透性低，因此在体内应用不可行(尽管AIP的十八烷基化形式可用于体外多细胞制剂)，而且KN-93和AIP不能口服给药。因此，新型CaMKⅡ抑制剂正在研发中，以投入临床应用。已研发的新型CaMKⅡ抑制剂包括Rimacalib(由Dainippon Sumitomo研发的SMP-114)和RA123456(由Sanofi研发)。这两种化合物均为ATP竞争性药物，这意味着它们对于已经自身磷酸化的CaMKⅡ也有效(与KN-93相反)。因此，无论CaMKⅡ激活的模式为Ca2+、氧化或糖基化等，Rimacalib和RA123456均有效。

5 CaMKⅡ的抑制剂在心律失常治疗中的应用

5.1 心房颤动

不能被CaMKⅡ磷酸化的RyR2突变的小鼠(S2814A突变体)对体内程序性电刺激诱导的心房颤动(Af)敏感性较弱[9]。而具有CaMKⅡ磷酸化的RyR2结构(S2814D突变体)的转基因(transgenic，TG)小鼠对诱导Af的敏感性较强。对Af的敏感性可通过预先注射KN-93减弱[10]，这意味着除了RyR2磷酸化之外，其他CaMKⅡ依赖性机制也在Af中发挥作用。一项2009年的研究给予表达RyR2突变功能的TG小鼠(RyR2 R176Q/+)程序性电刺激，其蛋白质印迹分析结果显示，与未接受刺激的小鼠相比，接受刺激的小鼠CaMKⅡ对RyR2(S2814)和PLN(T17)磷酸化作用增强，并与诱导CaMKⅡ激活的频率一致。用KN-93处理的RyR2 R176Q/+小鼠接受刺激时，Af的发生率降低，PLN T17磷酸化作用的RyR2 S2814位点磷酸化程度降低。在体外从RyR2 R176Q/+小鼠提取体外心肌细胞，结果显示KN-93能降低舒张期升高的Ca2+泄漏，并可改善体外RyR2 R176Q/+心肌细胞的异位活性增强。CaMKⅡ抑制性肽AC3-I的TG过表达也减少Af的诱发，这与药理学中CaMKⅡ的抑制作用相一致。研究表明，敲除了RyR2稳定亚基FKBP12.6的TG和CaMKⅡ磷酸化位点S2814功能丧失性突变的小鼠诱发Af，CaMKⅡ是罪魁祸首。S2814A突变减少了SR的Ca2+泄漏和DADs的发生，从而减少了程序性电刺激对Af的诱发率。

在体外心肌细胞中，高龄小鼠(约24月龄)舒张期SR Ca2+泄漏比低龄小鼠(约16周龄)多，KN-93可改善SR Ca2+泄漏。Af通常(但不总是)起源于肺静脉，Lo等证实用异丙肾上腺素或苯肾上腺素这两种肾上腺素能刺激体外的兔肺静脉，KN-93可降低其非持续性自发活动的发生率。与窦性心律相比，慢性Af患者的体外右心房细胞SR Ca2+泄漏显著增加，CaMKⅡ抑制剂KN-93可使其降至正常值[10]。SR Ca2+泄漏与舒张期Ca2+升高直接相关，同样CaMKⅡ抑制剂可使其降至正常值。

慢性Af患者的右心房组织中氧化型钙/ox-CaMKⅡ升高。研究表明，提取组织前未应用血管紧张素转化酶抑制剂(angiotension converting enzyme inhibitors，ACEI)治疗的Af患者组织中，CaMKⅡ的表达增加。然而在提取组织前应用了ACEI治疗的Af患者组织中，与SR相比，CaMKⅡ的表达并未增加，ox-CaMKⅡ也大幅度降低[9]。

研究表明，长期应用血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)会增加Af的发生率。机制是AngⅡ通过NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)途径诱导ROS的产生，导致CaMKⅡ氧化激活，进而引起RyR2 S2814过度磷酸化，从而诱导SR Ca2+泄漏，增加了DADs的发生，因此Af的发生增加。然而也有来自阵发性Af患者的数据表明，虽然SR Ca2+泄漏、相关的自发性Ca2+释放事件和DADs对于这些患者心律失常的发生很重要，但由于样本中CaMKⅡ自身磷酸化和RyR2 S2814磷酸化没有发生改变，因此SR Ca2+泄漏的机制可能不同，疾病的这个阶段由CaMKⅡ介导。

雷诺嗪能有效治疗Af[11]。Af晚INa升高且CaMKⅡ依赖性SR Ca2+泄漏增加[12]使雷诺嗪有望用于Af的评估和治疗，这更多的是考虑到本文之前讨论的晚INa和CaMKⅡ之间潜在的正反馈循环。在体外的野生型鼠心房肌细胞中，自分泌运动因子Ⅱ(autotaxinⅡ，ATXⅡ)介导晚INa增加，导致AP延长，并增加舒张期SR的Ca2+泄漏。灌注雷诺嗪导致动作电位间期回到基线，并且在ATXⅡ处理的细胞中，雷诺嗪(或TTX)也降低Ca2+泄漏。AIP以相似的方式降低ATX诱导的Ca2+泄漏，提示CaMKⅡ是ATX介导的Ca2+泄漏的中介物。

继发于Na+超载的Ca2+增加的作用机制尚不清楚。Viatchenko-Karpinski等证实，在渗透性Ca2+夹闭的兔心室肌细胞中，随着细胞质Na+的增加，SR Ca2+泄漏的增加与细胞质Ca2+的变化无关。相反，Fischer等证实用NCX抑制剂KB-R9743(KBR)处理后，心房细胞中ATX介导的Ca2+泄漏降至基线水平，并将其结果解释为KBR可以抑制NCX依赖性细胞质Ca2+过载，这反过来会激活CaMKⅡ。

一项向鼠心脏的右心房灌注ATXⅡ的蛋白质印迹分析结果显示，CaMKⅡ自身磷酸化(T287)和CaMKⅡ靶向磷酸化增强(PLN的T17，RyR2的S2814)，这与本文讨论的升高的Na+激活CaMKⅡ相一致。用雷诺嗪、TTX或AIP预培养会使其减弱。在另一项体外大鼠右心房心肌细胞的研究中，ATXⅡ介导晚INa增加，再次印证ATXⅡ会诱发细胞心律失常。在这个模型中，KN-93和AIP以及晚INa受体阻滞剂雷诺嗪和GS967可以抑制细胞发生心律失常，并减少CaMKⅡ-T28自身磷酸化。晚INa阻滞剂联合应用AIP可以降低CaMKⅡ T287自身磷酸化，其效果明显优于单独应用AIP、雷诺嗪或GS967。此外，联合应用雷诺嗪或GS967与KN-93或AIP比单独应用任何药物更有效地减少细胞心律失常的发生。药物联合应用比单独应用任何药物更有效地降低舒张期Ca2+，CaMKⅡ抑制剂与晚INa阻滞剂联合应用在Af的治疗和预防中更有效[12]。

雷诺嗪用于人类Af的支持性证据来源于一项对人体外右心房心肌细胞的研究，研究结果显示，Af患者晚INa增加(与窦性心律相比)，应用雷诺嗪可减弱晚INa。雷诺嗪还可减少人体外右心房肉柱中由高浓度Ca2+或电解质液中异丙肾上腺素引起的期前收缩。然而在雷诺嗪治疗人类Af得到的第一批临床数据中，两种结果均存在。在最近的一项121例前瞻性单盲随机试验中，与单独用胺碘酮相比，联合应用胺碘酮与雷诺嗪提高了心脏电复律至SR的比率[13]。然而，最近一项研究评估了三种剂量雷诺嗪对电复律后Af复发的影响，研究结果显示，与安慰剂组相比，治疗16周后Af复发的时间并未延长，与安慰剂组相比，两个最高剂量组的汇集分析无统计学意义[14]。在阵发性Af和植入起搏器的患者中，单独应用雷诺嗪或Ⅲ类抗心律失常药物dronedarone都不能减少Af，而雷诺嗪与dronedarone联合应用可降低Af的负荷[15]。

综上所述，CaMKⅡ是Af致心律失常的重要诱因，特别是CaMKⅡ诱导的SR Ca2+泄漏，CaMKⅡ抑制剂对治疗Af有益。CaMKⅡ的氧化激活是Af发病的重要机制。临床上可用的药物如ACEI或血管紧张素受体阻滞剂和晚INa抑制剂也可降低CaMKⅡ活性并降低Af的风险。

5.2 遗传综合征

5.2.1 儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速

儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia，CPVT)是一种与RyR2突变相关的遗传综合征(在其他心肌蛋白中的程度较轻)。情绪或身体的压力会导致室性心律失常，患者突发心源性猝死的风险很高。

在小鼠CPVT模型(RyR2 R4496C敲入)中，用CaMKⅡ抑制剂KN-93预处理小鼠可以防止由腹膜腔内注射肾上腺素/咖啡因诱导的持续性室性心动过速(ventricular tachycardia，VT)。在这些小鼠的体外心肌细胞中，异丙肾上腺素增加触发活动和自发性Ca2+释放事件的发生，但应用KN-93或AIP可减少这两种事件的发生。

从具有杂合RyR2突变的患者中获得诱导多能干细胞衍生的心肌细胞，研究结果显示，其在自发收缩期间DADs发生率高，应用异丙肾上腺素刺激时则更高。这些心肌细胞还发生DADs，并且当以0.5 Hz磁场刺激时触发活性，类似于本文之前讨论的小鼠RyR2 R4496C心肌细胞。在多能干细胞衍生的心肌细胞和这些心肌细胞的多细胞丛中，KN-93可以降低异丙肾上腺素引起的DADs的发生率，消除多重位点(基线水平和异丙肾上腺素介导)Ca2+瞬变的增殖并返回该簇的起源，激发单一的外围起始位点[16]。因此CaMKⅡ抑制剂有希望用于CPVT患者的评估。

5.2.2 2型长QT综合征

2型长QT综合征(type 2 long QT syndrome，LQT2)由一种编码包含复极IKr电流的心脏hERG通道的KCNH2基因的功能丧失性突变引起。这种综合征的特点为它是由听觉刺激或惊吓引起的心律失常，这些往往是由先前的EADs引起的尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes，TDP)心律失常。

这就需要进一步研究长QT综合征中的CaMKⅡ抑制剂。最近有证据表明，KN-93具有脱靶效应而直接抑制IKr[18]。因此，为了更好地认知CaMKⅡ抑制剂的效果，有必要评估LQT2中的其他CaMKⅡ抑制剂。

5.3 窦房结功能障碍

CaMKⅡ通过其对细胞内Ca2+动力学的作用而在起搏点活动中起到重要的作用，在此项研究中，CaMKⅡ抑制剂、AIP-特异性肽抑制剂或KN-93抑制CaMKⅡ引起L型钙电流振幅降低并完全捕捉窦房结细胞。有研究表明，CaMKⅡ对抗心率大约一半的作用来自于对窦房结细胞的作用，并且用AngⅡ灌注小鼠会导致心房和窦房结中ox-CaMKⅡ增加。 Ox-CaMKⅡ触发窦房结细胞凋亡、心房纤维化和传导减慢，诱发窦房结功能障碍(sinus node dysfunction，SND)[19]。在小鼠的心脏或窦房结中，CaMKⅡ的靶向抑制作用保护其免受AngⅡ的毒性作用，包括窦房结细胞凋亡、纤维化和SND。与窦性心律患者相比，在患有SND和Af患者的右心房中，ox-CaMKⅡ水平升高，AngⅡ输注的小鼠的心房中ox-CaMKⅡ也升高[20]。与盐水灌输的小鼠相比，这些小鼠的ROS、SR Ca2+激发、DAD均升高，Af的敏感性提高。具有抗CaMKⅡ氧化基因的小鼠和缺乏功能性NADPH氧化酶(p47-/-)基因的小鼠对AngⅡ介导的Af有抵抗性。这些数据表明，Af和SND的病理生理学中包含ox-CaMKⅡ，ox-CaMKⅡ在这两种疾病的临床共存和协同作用中发挥重要的作用。

6 具有潜在临床应用的新型CaMKⅡ抑制剂

Rimacalib(SMP-114)是一种经临床测试的小分子ATP竞争性CaMKⅡ抑制剂，由Dainippon Sumitomo开发用于类风湿性关节炎的治疗。最近研究证明，Rimacalib可减少体外人心房肌细胞和体外小鼠心室肌细胞的SR Ca2+泄漏。值得注意的是，致心律失常的自发性Ca2+释放事件可以被Rimacalib抑制。CaMKⅡ的抑制作用很安全，因为有研究发现，基础Ca2+瞬变振幅、SR Ca2+含量(咖啡因诱导的Ca2+瞬变振幅)和SERCA-功能(Ca2+瞬态衰减)不会被Rimacalib改变[20]。然而，迄今为止还没有关于Rimacalib心脏效应的活体试验数据，它是CaMKⅡ抑制剂中距临床使用最遥远的药物。

最近研究发现，在CaMKⅡδc-TG小鼠中，通过基于导管的程序性电刺激足量应用新型的、也是ATP竞争性CaMKⅡ抑制剂——RA123456(由Sanofi研发)，可减少房性和室性心律失常的诱发，可显著降低房性和室性心律失常的诱发率。心电图的参数，特别是QTc，不会被RA123456改变。这些抗心律失常作用至少部分是由于SR Ca2+泄漏减少，这在人体衰竭的左心室心肌细胞中也尤为重要[21]。与用vehicle(载体)处理的小鼠相比，在横向主动脉缩窄性心力衰竭模型中长期应用RA123456也显著减缓心力衰竭的发展，然而，RA123456尚未在人体中进行测试。

目前正在研发通过稳定RyR2直接减少SR Ca2+泄漏的化合物，如K201和S107等，但迄今为止关于这些化合物的抗心律失常作用的数据有限。RyR2 R2474S CPVT突变的小鼠SR Ca2+泄漏增加，并且更易快速起搏，诱发Af。在这些小鼠中，通过抑制FKBP12.6从通道中解离来稳定RyR2的化合物S107降低了SR的Ca2+泄漏，并且通过起搏降低了Af的诱发[22]。K201是另一种通过恢复FKBP12.6与RyR2结合而减少SR Ca2+泄漏的化合物，在无菌性心包炎的犬模型中对Af具有保护作用，并且在RyR2 R4496C CPVT突变的小鼠心肌细胞中，毒毛旋花苷G介导SR的Ca2+泄漏降低，致心律失常事件发生减少。然而，除了RyR2之外，K201已被证实影响细胞电生理的其他靶点，如SERCA。无论是专门针对一个CaMKⅡ依赖性机制(SR Ca2+泄漏)，还是以更多的方式通过抑制CaMKⅡ影响致心律失常效果，均是一个更好的药物基因组学战略，这将成为未来研究的主题。

7 总结与展望

抑制CaMKⅡ正成为治疗和预防心律失常很有前景的新原理。CaMKⅡ依赖性RyR2过度磷酸化引起的SR Ca2+泄漏以及晚INa尤为重要。尽管在小动物中进行细胞实验和研究很有前景，但在用于人类之前，仍缺乏大型动物模型的研究结果以验证抑制CaMKⅡ的抗心律失常潜能及安全性。其中一个原因是缺乏可口服并适用于人体的化合物。克服这些障碍后，新型CaMKⅡ抑制剂，如RA123456和Rimacalib将可用于临床试验。Na+、ROS和CaMKⅡ信号之间的相互作用似乎存在，可干预此轴调节CaMKⅡ激活/信号传导。因此，已用于临床的药物如晚INa抑制剂雷诺嗪，因此原理而可以预防CaMKⅡ依赖性心律失常。进一步的研究很有必要，以确定雷诺嗪是否可以单独用于抗心律失常或是否可用作附加疗法。抑制CaMKⅡ在心律失常治疗中是否成功，以及用作一项单独疗法还是联合治疗，都将在不久的将来得到答案。