数字PCR技术及其在微生物检测中的应用

◎ 吴 冰，蔡先全，郑传发，邱 霞，萧绮倩

（中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东 中山 528403）

1999年，Kenneth Kinzler与Vogelstein B提出了“数字PCR（Digital PCR，dPCR）”的概念[1]，该技术将DNA或RNA样品分散成大量的微反应单元，然后对众多微反应单元内的靶序列进行单分子模板PCR扩增、荧光检测和统计学分析，实现绝对定量。该技术不依赖标准曲线和标准品，直接检测样品中核酸的原始浓度，比传统荧光定量PCR的灵敏度和精确性更高。

1 数字PCR技术的基本原理

目前数字PCR主要分为3种：微孔式数字PCR、微滴式数字PCR和微腔式数字PCR。微孔式数字PCR是最早出现的数字PCR技术，在96或384孔聚丙烯板上完成；后来出现了微腔式数字PCR，采用了由多层软刻蚀技术及聚二甲基硅材料制作成的系统；由于传统的数字PCR技术取样、操作复杂，成本较高；便衍生了微滴式数字PCR技术，微滴式数字PCR是目前相对成熟的数字PCR平台，利用油包水乳化微滴颗粒作为反应器进行检测。目前，数字PCR仪主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系统和RainDance公司的RainDropTM dPCR系统。

目前，应用最广泛的是微滴数字PCR，该技术具有灵敏度高、成本低的特点，可实现DNA的绝对定量。其工作原理是把DNA分子稀释到一定浓度，生成一定数目的微滴，然后进行PCR扩增，读取阳性微滴数目。再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数[2-3]。相关文献表明，与荧光定量PCR相比，数字PCR对核酸含量较低的样品检测准确率和灵敏度都较高[4-8]。

2 数字PCR的优势

数字PCR技术是一种核酸分子绝对定量技术。它将荧光定量PCR反应体系分配到大量微小的反应器中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子（DNA模板），在反应器中进行“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后，检测阳性反应单元数目，利用统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。

数字PCR不依赖对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。此外，由于数字PCR在判读结果时，仅判断“有/无”两种扩增状态，因此荧光信号与设定阈值线的交点对其无影响，不依赖于Ct值。所以，数字PCR的读数结果受扩增效率的影响很低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高，数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大地降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度。因此，数字PCR技术特别适合检测复杂背景中的稀有突变。

由于数字PCR具有灵敏度高、特异性好和精确性高的优点，它在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测、表达量微小差异鉴定和拷贝数变异检测等方面表现出的优势已被普遍认可，在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、单细胞基因表达和NGS测序文库精确定量与结果验证等诸多方面具有广阔研究前景。Kalorama Information发布的研究报告显示，到2019年全球数字PCR市场预计将达39.7亿美元，中国是最主要的新兴市场[9]。

3 数字PCR在微生物检测领域的应用

核酸扩增技术是病原微生物检测的一个重要方法，目前实验室主要采用基于Taq Man探针法的荧光定量PCR体系对病原微生物（病毒、细菌、支原体等）进行核酸水平的检测。虽然荧光定量PCR是目前病毒分子检测方面的“金标准”，应用广泛，但依赖于标准曲线的Ct值，而用于绘制标准曲线的标准品缺乏统一的计量标准。而数字PCR则不需要标准曲线，因此，被科研人员大量应用于病毒和致病菌的检测研究中，如HBV[10-11]、肠病毒[12]、腺相关病毒[13]、巨细胞病毒[14]、单核细胞增生李斯特氏菌[15]、结核分支杄菌[16]、产志贺毒素大肠杆菌[17]、沙门氏菌[18]、大肠杆菌O157:H7[19]等。

4 结语

数字PCR与传统荧光定量PCR相比具有独特的技术优势，实现了单分子DNA绝对定量，能够精准分析出目标基因的浓度，目前已成为分子生物学研究中的重要工具。

虽然目前数字PCR检测多处于发展初期，大多还处于实验室的研发阶段，没有真正应用到微生物定量检测中。但是，该方法具有简单、快捷、灵敏、特异性强且综合了荧光定量PCR的准确性及基因芯片的高通量特点，并且不依赖标准物质定量，有望成为核酸绝对定量的新标准。今后，应该将数字PCR法与现有的传统微生物检测方法相结合，制定微生物数字PCR检测技术标准，提高样品中病原菌的检出率，并推广应用，为微生物检测提供技术支持。