大鼠脑髓鞘坚牢蓝染色的两种不同复染方法比较

杨德慧 古梓婷 赖胜敏 罗 利 马宇昕 刘 靖

(广东药科大学基础学院人体解剖学教研室, 广州 510006)

在中枢神经系统中,髓鞘是由少突胶质细胞的突起缠绕神经元轴突所形成的管状节段性结构,其主要成分是70%脂类和30%蛋白质构成的鞘磷脂结构[1],而有髓神经纤维是大脑白质的重要组成部分。目前,检测髓鞘脂类表达的方法有多种,其中劳克坚牢蓝(luxol fast blue, LFB)染色是一种较为常用的髓鞘染色方法[2-3]。但LFB染色也有不同的复染方法,其染色效果亦有差异。本研究通过对成年鼠和幼鼠2种不同鼠龄阶段的大脑髓鞘LFB染色,比较焦油紫和伊红2种不同复染方法的优缺点,为相关研究提供合适的染色方法。

1 材料和方法

1.1 试剂和动物

LFB髓鞘染色液(G3245和G3240)购于Solarbio公司。6周龄SPF级SD大鼠购于广东省医学实验动物中心,许可证号SCXK(粤)2013-0002,自由摄食和饮水。雌鼠与雄鼠合笼后单笼饲养,在分娩后第14天(分娩当天为0d)对母鼠和仔鼠进行取材。本研究经广东药科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 动物取材

仔鼠出生后第14天,母鼠和仔鼠在10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉下,以0.9%生理盐水冲洗和4%多聚甲醛溶液灌注,灌注固定后取脑置于4%多聚甲醛中固定48h,组织常规脱水和石蜡包埋,用于坚牢蓝染色。

1.3 LFB染色及复染

(1) 脑组织切片脱蜡至水： 二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15min;100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇各5min。(2) 切片转入LFB染色液,在56℃恒温烘箱染色24h。(3) 脑组织切片入95%乙醇洗去多余的染色后换双蒸水洗。(4) 脑组织切片分别入Luxol分化液、70%乙醇分色30s和1min,水洗、镜检至最佳效果。(5) 复染： 焦油紫复染法,组织切片入新配的焦油紫染色约1min,在显微镜下观察到明显的细胞核和尼氏小体。随着焦油紫使用次数的增加,染色时间可适当延长。伊红复染法,组织切片入新配的伊红复染约2min,切片被染成淡红色,与LFB染色重叠部分显示为蓝紫色。(6) 双蒸水洗3次后,切片用95%、100%乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封固。

2 结果

2.1 母鼠胼胝体和内囊LFB染色

胼胝体LFB染色呈蓝色丝状物,从胼胝体向皮质下白质延伸。内囊LFB染色呈斑块状、荨麻疹样分布。在焦油紫复染的切片中,LFB染色呈深蓝色,髓鞘脂类较少的部位染成浅蓝色,背景为白色,可见细胞核和尼氏小体分布(图1，见封底)。伊红复染的LFB染色中,LFB染色呈蓝紫色,背景为红色,脂类减少的部位被伊红填充为红色(图2,见封底)。

2.2 仔鼠胼胝体和内囊LFB染色

幼鼠胼胝体和内囊髓鞘均还处在发育时期,其染色尚不具有成鼠的形态,焦油紫法中LFB染色呈浅蓝色,细胞核和尼氏小体为蓝色(图2,见封底);伊红法的LFB染色呈蓝紫色,背景为红色(图2,见封底)。

3 讨论

髓鞘染色在白质性脑病的诊断和研究中具有重要作用,可用于检测髓鞘发育的情况和脱髓鞘的程度。髓鞘染色常用的方法主要包括脂溶性染料浸染法、媒染法以及锇酸与类脂的特异反应等[2-3]。LFB染色属于脂溶性染料浸染法中的一种,尽管染色的具体步骤和时间等方法还有待于统一,但LFB染色的确是一种比较常用而可靠的髓鞘染色方法[4-5]。此外,也有研究使用油红O进行髓鞘染色,但油红O染色需要进行冰冻切片、配制油红O染液中的异丙醇易挥发且对人体健康有害、切片不能长期保存,而LFB染色可以避免这些缺点[6]。LFB属于铜酞菁染料,在乙醇溶液内能够与髓鞘磷脂结合,染色后髓鞘着色鲜明,且有一定的特异性。与其他染色方法相比较,LFB染色具有操作简单、价格低廉和着色鲜明易于观察等优点[1]。在LFB染色过程中,Luxol分色是关键步骤,能够决定实验的成功与否。但不同的复染方法所产生的背景不同,显示LFB染色的鲜明度不同,特别是在幼鼠髓鞘发育尚未发育成熟的情况下,对LFB染色的敏感度要求更高。因此,本实验通过对LFB染色检测正常成年鼠和幼鼠大脑髓鞘,比较焦油紫和伊红2种复染方法的优缺点。

伊红是一种酸性化合物,容易与碱性的细胞质结合呈现红色,与LFB染色部分重叠显示为蓝紫色,蓝紫色与红色形成鲜明对比。焦油紫是一种碱性染料,能够与细胞中酸性物质结合,将神经元的尼氏体、核仁染成蓝色。在本实验中,焦油紫和伊红两种复染方法均能清晰地显示母鼠胼胝体和内囊的LFB染色,与皮质部分界限清楚。然而在白质中髓鞘脂类减少的部位,焦油紫法LFB染色呈现浅蓝色,与深蓝色部分区分不够明显。而在伊红法中,脂类减少的部位被伊红所填充,与蓝紫色LFB染色形成鲜明的对比,更具直观性。另外,幼鼠由于髓鞘尚未发育成熟,LFB染色着色少且浅,焦油紫法的LFB染色呈浅蓝色,颜色较接近细胞核和尼氏小体。伊红法的LFB染色呈蓝紫色,与红色的伊红形成更鲜明的对比。在脱髓鞘和髓鞘发育的相关研究中,伊红复染法更能够敏感地反映出髓鞘LFB染色的变化,如果单纯研究脱髓鞘或者髓鞘的发育,可以应用伊红复染法。而焦油紫复染法可以观察到神经元细胞核和尼氏小体的变化,适用于研究脱髓鞘与神经元损伤、髓鞘再生与神经元再生之类的相关研究[7]。因此,可以根据实验目的不同而来选择合适的LFB复染方法。