牛气肿疽的病原学诊断方法

田 苗

（辽宁省鞍山市岫岩满族自治县动物疫病预防控制中心， 辽宁 鞍山114300）

牛气肿疽，病原是气肿疽梭菌，可经消化道直接感染，创伤的皮肤也可引发感染。病牛及其排泄物和其污染的饲料、饮水、土壤都是传染源，可引起病牛高热、跛行，胸颈部、大腿等身体肌肉丰满部位出现气性炎症肿胀，指压患部有捻发音。严重病牛食欲废绝，反刍停止，体温下降，呼吸困难，直致死亡。本病发病急，病程短，危害严重，所以在短时间内准确诊断显得尤为重要。

牛气肿疽病虽然可根据流行病学、临床症状及病理学变化等做出初步诊断，但确诊须经实验室进行病原分离培养等一系列工作。

1 病料采集和处理

气肿疽多为败血症，故可采取血液或任何脏器，且宜采取管骨，既便于保存运送，又不易污染。在无菌条件下采取刚刚死亡（夏日2～4h，冬日12h内）病牛的且有病变的肌肉小块，约10cm3大小，浸于溶解后的石蜡液中，蜡凝固后，即取出用塑料纸包运，与此同时制备血液、脏器、肌肉、渗出物涂片，以备染色镜检。疑为此菌时要作肝表面触片。

2 细菌学检查

血液或组织涂片，可见大杆菌、无荚膜、芽孢比菌体大，位于中央或偏端，革兰氏染色阳性。若为炭疽杆菌则有荚膜而不见芽孢。肝表面触片为单个或短链，不呈长丝状。如为腐败梭菌，则肝表面触片可呈长丝状。但仅以涂片或触片尚不能作最后的确诊。

3 病原分离及鉴定

将肝、肌肉或骨髓等接种于葡萄糖鲜血平皿或鲜血平皿（厌氧培养）或熟（庖）肉基中，1～2d，此菌在平皿上长出圆形、边缘有时不太整齐、纽扣状菌落，或中心凸起，或有同心圆，菌落直径达2～4mm，周围有β溶血环。幼年培养物涂片染色呈革兰氏阳性。必要时也可取小块肌肉，移植于肝块肉汤培养基中，经24h后再重复接种于葡萄糖鲜血琼脂平板上，反复操作至获得纯培养为止。

4 动物试验

接种病料肌肉乳剂或培养物0.5～1mL，肌肉注射于豚鼠。接种后豚鼠常在24～48h内死亡。注射动物可测细菌毒力，亦可将死亡豚鼠的肌肉、肝脏制片镜检及作细菌的分离培养鉴定。

5 分离物的鉴定

5.1 细菌形态及染色特性 气肿疽梭菌是有芽孢两端钝圆的粗大杆菌，1.3～3.4μm×0.5～0.8μm，在病料中一般为直形，单个或成对排列。无荚膜，周身鞭毛，运动活泼。芽孢不仅在动物体外形成，患病牛的肌肉与渗出液中亦有。芽孢为卵圆形，位于菌体中央或近端，可比菌体大，使带芽孢的菌体呈纺锤状或汤匙状。在陈旧的培养物中可见到复数游离的卵圆形芽孢。本菌为各种苯胺染料着色，病料与幼龄培养物中的菌体为革兰氏阳性。而老龄培养菌大部分为阴性。5.2 生长及生化特性

本菌厌氧，发育适温为37℃，pH为7.2～7.4，在适宜培养基中24h即生长。在葡萄糖鲜血琼脂上为圆形、平坦，中心隆起似纽扣状菌落，周围有微弱的β溶血环。在琼脂上为边缘不整齐的菌落，大小为2～3mm，呈淡蓝色。在深层葡萄糖琼脂中发育成细弱突起的球形或扁豆形的小菌落。移植于肉肝汤经12～24h呈均等混浊并产气，至24～48h，上液清亮，管底有松散的白色沉淀。熟肉基中表现为分解糖型。于脑培养基中发育良好，但不变黑。将菌落钩取移植于熟肉基中，作生化试验，其生化特性为：发酵葡萄糖、单奶糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、蔗糖产酸产气。不发酵鼠李糖、菊糖、卫矛醇、水杨素（苷）、甘油或甘露醇，还原硝酸盐，产硫化氢，石蕊牛奶有时无变化，有时微产酸，据此可做出确诊。

5.3 毒素检查

本菌在厌气肝汤或熟肉基中培养可产生 α、β、γ、δ 四种外毒素。α毒素即是耐氧的溶血素，能溶解牛的红细胞，α毒素还是神经毒素，能引起皮肤坏死和纤维蛋白溶解；β毒素是脱氧核糖核酸；γ毒素是透明质酸酶；δ毒素是不耐氧的溶血素。这四种毒素不耐热，在52℃下30min可被破坏；在室温下放置24～48h毒性明显下降。用外毒素静脉注射小鼠或豚鼠可致死，但家兔有明显的抵抗力。

α毒素可用其对小鼠致死测定。β毒素可用影响白细胞着色法来检查。影响白细胞着色法：系用家兔血液涂片，在空气中干燥，用甲醇固定，将涂片的一半浸于用生理盐水2倍稀释的细菌培养滤液中，另一半作为对照；同时用生理盐水代替细菌培养液同法操作，作为生理盐水对照。玻片直立于培养液或盐水中置38℃水浴中18h，取出用蒸馏水冲洗，血片染色（瑞氏或姬姆萨法）镜检，白细胞染色浅并现空壳为阳性，有本毒素存在。毒素浓度高时，可看到没有着色的白细胞，红细胞不受影响。使50%白细胞产生严重破坏的滤液稀释度为毒素滴度，与一单位抗毒素血清混合后，仍能破坏片中50%白细胞的最小细菌培养滤液量，为1个毒素单位。γ毒素可用酸刚果红乙醇（ACRA）法测定。δ毒素可用溶血法测定。但因其不耐氧，在测定过程中，需用适宜的还原剂，如巯基乙酸钠达0.05%～0.1%，以避免毒素受氧的作用而被灭活，不能测定。