结核实验室诊断技术研究进展

何 珍综述，王 璞审校（重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆400016）

结核病是结核分枝杆菌感染引起的呼吸道传染病，是全球单一病原体感染导致死亡的第九大原因，位于人类免疫缺陷病毒（HIV）∕艾滋病之前。2016年，全球新发结核病例近1 040万例，其中56%在印度、印度尼西亚、中国、菲律宾、巴基斯坦。约60万新发结核病例对利福平耐药，其中49万例为耐多药结核（MDR-TB）。47%的患者主要分布在印度、中国和俄罗斯；估计有近170万例患者死于结核病[1]。早期、准确、快速诊断结核是防治的关键。近年来，结核实验室诊断技术通过不断创新取得了新的进展。2017年11月新发布的《WS288-2017肺结核诊断标准》更对肺结核诊断标准做出重大调整，本文就近年来结核实验室诊断技术的进展作一综述。

1 细菌学检测

1.1 涂片镜检

1.1.1 改良抗酸染色 分枝杆菌抗酸染色法快速、简易、价廉，仍为目前应用最广的结核检测方法。该方法主要分为7个步骤：玻片处理、标本收集、标本固定、复红染色、酒精脱色、美兰染色、镜检观察。对任一步骤改进均可提高检测效率。CHEN等[2]采用粟氏FMMU6型拨片离心沉淀仪处理脑脊液，再用多聚赖酸处理过的玻片收集其中的白细胞并用TritonX-100处理，增加了细胞壁对染色剂的通透性，使胞内菌着色更好，显著提高了检出率及敏感性。邹月丽等[3]采用改良抗酸染色对脑脊液进行检测，将阳性率由10.00%提高至88.57%。张继萍等[4]采用传统及改良抗酸染色法对菌阴结核支气管肺泡灌洗液进行检测，阳性率分别为38%、82%。

1.1.2 荧光染色 利用结核分枝杆菌的嗜酸性及对荧光染料的亲和性，以石炭酸为媒染剂加入染色液中，使分枝杆菌染上荧光。痰结核分枝杆菌在荧光显微镜20～40倍物镜暗视野下呈亮绿色荧光，与暗色背景反差明显；在100倍油镜下呈杆状或短棒状，极易被发现，不易漏检[5]。对于某些患者因长期服用药物，使抗酸性遭到破坏的结核分枝杆菌，其荧光性仍可保留，虽抗酸染色阴性，但在荧光染色后呈阳性[6]。荧光染色较抗酸染色阳性率高，尤其适用于病变活动轻、排菌量较少的患者[7-8]。近年来，LED荧光显微镜的出现，推动了荧光染色镜检的应用。与传统的汞灯光源相比，其阅片效果好、阅片时间短、操作方便，不需要暗室，且光源寿命长，成本低[9]。CEJUDO-GARCÍA 等[10]研究发现，将痰涂片经紫外线照射固定后再行金胺O荧光染色，可进一步提高镜检阳性率。RYAN等[11]使用新型荧光染料SYBR GOLD对体外培养的结核分枝杆菌涂片进行镜检，发现其检测率高达99%。新型微型物镜与数字化荧光涂片镜检技术结合如CellScope、TBDx自动显微镜系统的研发，涂片镜检具有快速、高效、高通量、全自动化、安全性高等优势[12-14]。

1.1.3 液基夹层杯法 液基夹层杯法与直接涂片法一样，采用抗酸染色并在显微镜下判读结果。其创新主要体现在标本离心集菌、消化方面[15-17]，标本通过消化灭菌、高速离心等处理后，大量抗酸杆菌沉淀于彭氏夹层杯底部，镜下菌量显著增加，提高了检出率。且经过消化灭菌的结核杆菌不再具有感染性，加上操作全程在密闭的彭氏杯中进行，保障生物安全性。此外，液基夹层杯涂片法还具有标准化程度高、保存时间长等优势。

1.2 分枝杆菌分离培养 分枝杆菌培养为诊断活动性结核的“金标准”[18]，其灵敏度高于涂片法，可鉴别结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌，并对药物敏感性进行检测。

1.2.1 快速培养基 以罗氏培养法为代表的固体培养法一般需要 4～6周，得到药敏结果还需 3～4周。以MGIT 960系统为代表的液体快速培养基将周期缩短至2周左右，且可对一、二线抗结核药物敏感度进行检测。MGIT960系统生长培养管底部含有被氧分子抑制的荧光指示剂，当氧被分枝杆菌生长消耗时，原先被抑制的指示剂被激活从而显示荧光。目前，常用的培养系统还包括BacT∕ALERT3D液体培养系统、ESP培养系统Ⅱ等，与罗氏培养法相比，它们均显著缩短了培养时间，且提高了阳性检出率[19-20]。但液体培养基容易污染[21-22]，且无法观察菌落形态及进行定量。且该系统所需试剂和检测仪器价格昂贵较贵，难以在基层实验室广泛开展。

1.2.2 噬菌体生物扩增法（PhaB） 分枝杆菌噬菌体只能感染活菌，未进入活菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活，而已进入菌体内的噬菌体不受影响。噬菌体在菌体内大量增殖，并将菌体裂解，释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞，并将其裂解，出现噬菌斑。通过检测噬菌斑的有无及数量，可判断待检标本中是否存在活的结核分枝杆菌或其他少数几种非结核分枝杆菌。谭守勇等[23]使用PhaB对涂阳痰标本的利福平耐药性进行检测发现，PhaB敏感度、特异度及准确率分别为94.8%、99.0%、98.4%。PhaB检测时间仅需2 d，敏感度高、特异度好，还能根据噬菌斑的动态变化观察治疗效果；操作简单，不需要特殊仪器，成本低，对结核的诊断及治疗具有重要价值。

1.2.3 薄层琼脂培养法（TLA） TLA使用固体培养基、显微镜来观察分枝杆菌菌落生长，是一种新型的低成本检测方法。可根据镜下观察到的特征杆状表型对结核分枝杆菌进行初步鉴定。TLA与PNB鉴别培养基联合检测可提高菌种鉴定的特异性。TLA敏感度、特异度与改良罗氏培养法相当，检出时间为9～11 d[24]。

1.2.4 显微镜观察药物敏感法（MODS） 结核分枝杆菌在液体培养基中生长会有特征性索状结构形成，并可通过倒置显微镜直接观察，对结核分枝杆菌的生长及耐药性进行检测。张慧涨等[25]发现，MODS药敏结果与罗氏比例法、BECTEC MGIT960法的一致性好，符合率高，检出时间仅7 d左右，具有快速、简便、廉价等优势，可作为快速诊断耐药结核的重要方法在基层医院推广。

2 免疫学

2.1 γ-干扰素释放试验（IGRAs） 当机体感染结核分枝杆菌后可产生特异性记忆T细胞，再次接触结核分枝杆菌时可产生和分泌γ-干扰素，故可通过检测γ-干扰素来判断是否感染结核分枝杆菌。常用的IGRAs有QuantiFeron-Gold test（GFT-G）和T-SPOT.TB 2种。GFTG通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后的记忆T细胞释放的γ-干扰素水平进行定量检测。T-SPOT.TB则利用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）测定在释放γ-干扰素的效应T细胞的数目。IGRAs使用的特异度抗原主要为ESAT-6和CFP-10，二者主要存在于MTB，在卡介苗及大多数NTM中缺失，故特异度高。2种方法均优于结核菌素试验（PPD试验），其中T-SPOT.TB检测敏感度更高，而GFT-G检测特异度更好[26]；应用IGRAs对免疫功能受损的患者（如HIV感染者）进行结核分枝杆菌潜伏感染（LTBI）筛查优于PPD试验[27]，阴性结果对排除结核分枝杆菌感染具有一定帮助。LIAO等[28]研究发现，结核性胸膜炎患者胸腔积液γ-干扰素水平为同步外周血的4～5倍，其敏感度（95.7%）及特异度（100.0%）均高于外周血（分别为78.3%、86.3%），提示胸腔积液行IGRAs检测具有较好的诊断价值。但IGRAs不能区分活动性结核病和LTBI，也不能准确预测LTBI发展为活动性结核病的风险。

2.2 蛋白芯片 结核分枝杆菌在增殖过程中会释放出大量特异度抗原刺激机体发生免疫反应，产生大量抗体。结核分枝杆菌免疫球蛋白G（IgG）抗体检测试剂盒（蛋白芯片）利用微阵列技术将结核菌特异性细胞壁脂多糖抗原（LAM）、经基因工程重组DNA技术生产并纯化的蛋白16 kD和蛋白38 kD特异性抗原固定在同一膜片上，与待检血清快速发生免疫反应，抗原抗体复合物再与胶体金标记的抗人IgG作用，形成紫红色斑点，再由阅片仪分析，对结核病进行诊断[29]。3种抗原中，LAM是分枝杆菌细胞壁重要成分，含量高，敏感性好[30]；38 kD抗原与16 kD抗原是结核分枝杆菌所特有的抗原，与其他分枝杆菌和非结核分枝杆菌不存在交叉反应，特异度强[31-32]，半小时内即可出结果，且结果由仪器判读，操作简单，可避免人为误差等。朱同华[33]报道该方法特异度为96.5%，灵敏度为83.0%。该方法可用于快速诊断结核病，尤其是菌阴肺结核、结核性胸膜炎及肺外结核的诊断[34]。

3 分子生物学

3.1 环介导等温扩增法（LAMP） LAMP利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下对核酸进行扩增，通过肉眼观察副产物焦磷酸镁白色沉淀的有无，判断靶基因是否存在。其灵敏度为92.6%～100.0%，特异度为87.14%～98.00%[24，35-36]。该方法全程所需时间不足 1 h，对反应条件要求不高，可通过肉眼观察结果，突破了传统分子生物检测技术昂贵设备及繁杂操作要求的限制，是一种适合现场和基层进行快速检测的方法。也是WHO重点推荐用于结核病诊断的新技术[37]。

3.2 分子线性探针技术（LPA） LPA基于多重聚合酶链式反应（PCR）原理，将PCR扩增、反向杂交和膜显色技术合为一体。使用经生物素标记的引物对目的基因进行扩增，再将扩增产物与特异性探针杂交，杂交物通过生物素标记的酶发生显色反应，从而判断靶DNA特定基因的碱基突变。使用LPA对MTB进行耐药性检测，具有较高的特异性与准确率，已得到WHO认可与推荐。目前，主要的商业化LPA试剂盒有INNO-LiPA和GenoType MtbDRplus，均用于一线结核药物耐药性的检测，其中GenoType MtbDRplus对耐利福平、耐异烟肼及耐多药检测的敏感度分别为95.8%、96.3%和97.7%[38]。而新一代 LPA试剂盒 GenoType MtbDRsl可用于快速检测乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物和二线注射类药物耐药性。

3.3 利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术 （Xpert MTB∕RIF）是集标本处理、DNA提取、核酸扩增检测和RIF耐药基因检测于一体的结核病和耐药结核病快速诊断技术，2 h内即可同时实现结核分枝杆菌和RIF耐药检测。全程在封闭环境中自动完成，无生物安全需求。被WHO誉为结核病诊断中革命性突破，是WHO的重点推荐技术。该技术以培养结果及表型药敏试验为“金标准”，感度为93.33%，特异度为94.12%[39]。建议对疑似结核病患者尤其是疑似MDR-TB患者和合并HIV感染者，首先使用 Xpert Mtb∕RIF技术检测；在MDR-TB或HIV感染率低的地区，建议使用Xpert Mtb∕RIF技术对涂片阴性病例行进一步检测[40]。

3.4 基因芯片 基因芯片于20世纪90年代开始用于结核诊断，随着近年来分子生物学技术的飞速发展，现已广泛在临床上使用。基因芯片将大量探针固定在特殊载体上，再与待测样本的核酸进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片法适用于不同类型标本，不需要培养即可进行直接分枝杆菌检测，并进行菌种鉴定，同时完成耐药性检测。其具有高通量、高效快捷、灵敏度高等特点[41]，可为临床快速诊治分枝杆菌感染、指导治疗提供可靠依据。相关研究结果显示，基因芯片法检测利福平耐药的敏感度为87.26%～92.00%，特异度为96.00%～98.00%；检测异烟肼的敏感度为77.4%～81.90%，特异度为 91.70%～96.90%[42-43]。

4 小结与展望

大多数因结核病导致的生命、财产损失均可以通过早期诊断和适当治疗而避免。目前，临床上可供选择的MTB检测方法众多，各有其优势及不足，合理选择适宜的诊断技术对结核的诊断至关重要。相信随着诊断技术的不断进步及对结核病致病机制研究的不断深入，医务工作者会寻找到性价比更高的诊断手段为临床服务，做到早期诊断并有效治疗结核病。