上皮细胞⁃间充质转化与非小细胞肺癌预后和耐药关系研究进展

2018-02-14娜综述康马飞审校桂林医学院广西桂林54000桂林医学院附属医院广西桂林5400

现代医药卫生 2018年21期

彭娜综述，康马飞审校（.桂林医学院，广西桂林54000；.桂林医学院附属医院，广西桂林5400）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，大多数患者被确诊时已处于疾病中、晚期，尽管目前手术、放疗和药物治疗等治疗水平在不断提高，但肺癌患者的病死率仍相当高，其主要原因是肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞的转移是一个复杂的演变过程，其主要机制涉及迁移、侵入、黏附、增殖和血管生成等步骤。近年来，越来越多的研究表明，上皮细胞-间充质转化（EMT）在肿瘤侵袭和转移的过程中扮演着十分重要的角色。本文就EMT在非小细胞肺癌中的研究进展作一综述。

1 EMT的概述及分类

1.1 EMT的概述 1982年GREENBERG在晶体状体细胞的研究中首次提出了EMT这一概念，其主要的特征是上皮细胞连接蛋白如E-钙黏蛋白的丧失、间充质标记物（如波形蛋白）的增加和细胞骨架重组等[1]，通过EMT作用，上皮细胞失去了细胞极性和与基底膜连接的多种上皮表型，从而获得了迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质等间质表型，在多种纤维化疾病、慢性炎症、肿瘤细胞的转移中发挥了重要作用。

1.2 EMT的分类基于EMT发生的生物学背景，将其分为3种不同亚型：（1）Ⅰ型与胚胎发育和器官形成有关，主要是通过EMT过程产生次级上皮细胞，从而实现胚胎形成过程中的细胞类型多样性。（2）Ⅱ型则是通过产生纤维细胞来修复炎症、创伤所造成的组织损伤，与创伤修复、组织再生和器官纤维化有关。（3）Ⅲ型是指与上皮细胞发生相关的表型转化，从而形成具有迁移能力的间充质细胞，并保持一定的上皮细胞特性，随着血流转移、定植在全身多个组织和器官中。

2 EMT的作用机制

EMT在肺癌中受多种内、外因素的调控，从转录、转录后mRNA加工到翻译和翻译后修饰，是一个复杂的过程。主要EMT步骤包括基因的修饰表达，以及上皮表型受抑制和间充质表型的激活[2]。EMT过程中涉及多种信号通路，如Wnt∕β-连环蛋白激酶、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、Rho∕Rac 和 Src。Ras是一种小 GTP 结合蛋白，可激活MAPK直接上调Snail家族表达，并通过触发Rho∕Rac和PI3K等信号诱导EMT[3]。Src能激活MEKMAPK信号通路，并诱导酪氨酸残基处的β-连环蛋白磷酸化，促进与E-钙黏蛋白的结合，降低上皮细胞极性，诱导EMT[4]。β-连环蛋白是Wnt信号通路的核心组成部分，研究表明，β-连环蛋白的缺失及其跟E-钙黏蛋白的相互作用可能与非小细胞肺癌患者不良预后有关[5]。其包括 E-钙黏蛋白、PI3K∕Akt和 Ras∕MAPK 通路在内的多种生长因子可与Wnt∕β-连环蛋白信号传导相交，以促进EMT发生。因此，肿瘤细胞失去顶端-基底外侧极化并获得了间充质样表型，从而增加了其迁移、侵袭和传播到周围组织或远处器官形成转移灶的能力[6]。

此外，EMT的发生还需要白细胞介素-6（IL-6）∕JAK∕STAT3 和转化生长因子-β（TGF-β）∕Smad 信号传导，以及TGF-β和Raf∕MAPK之间的协同作用。IL-6是JAK∕STAT3和PI3K∕Akt途径的主要激活剂，在表皮生长因子受体（EGFR）突变的肺腺癌组织中存在IL-6的表达[7]。有研究证明，抑制IL-6∕STAT3途径可以使EMT逆转，并使EGFR-TKI耐药的人肺癌细胞对埃罗替尼或吉非替尼重新敏感[8]。

有研究认为，SAHA作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）的一员，可降低上皮标志物E-钙黏蛋白的表达，并增加间质标志物波形蛋白的表达，诱导肺癌A549细胞的EMT，使细胞迁移能力和形态学发生改变，并最终促进肿瘤转移，增加癌细胞扩散的风险。通过siRNA沉默Slug可以逆转SAHA诱导的EMT标记物表达和细胞形态学变化[9]。这为肺癌的治疗提供了更广阔的思路。总之，EMT是一个复杂的过程，其具体作用机制尚不明确。

3 EMT转录因子与非小细胞肺癌的预后

3.1 Snail家族 Snail家族是包括 Snai1和 Snai2（也称为Slug）的锌指蛋白，Snail家族是一类非常不稳定的转录因子，对翻译后修饰很敏感，通过羧基末端的锌指结构域与E盒的DNA序列结合来抑制上皮细胞相关基因的表达，在EMT的发生和调控中扮演重要角色[10]。MERIKALLIO等[11]的一项研究表明，降低Snail表达可增加 SK-MES1 细胞系中闭锁蛋白（claudins）-3、4、7 mRNA的表达，从而阻碍EMT的进展，而Snail低表达的患者其生存期明显长于Snail高表达的患者，提示Snail的表达与鳞状细胞癌和腺细胞癌患者不良预后有关。在MERIKALLIO等[12]的另一项研究中发现，Slug在Ⅰ～Ⅱ期的肺鳞状细胞癌及Ⅲ期肺腺细胞癌中高表达，且发现Slug的表达只在肺鳞状细胞癌中与波形蛋白呈正相关（P=0.016），在这2种类型的肺癌中，未发现Slug表达与肿瘤大小（P=0.49）、淋巴结转移（P=0.59）或远处转移（P=0.61）的相关性。Cox回归分析表明，Slug的表达具有独立的预后价值（P=0.037），尤其在鳞状细胞癌中，Slug高表达的患者预后较差（P=0.006，对数秩）；而在腺癌中，Slug的表达与生存率无关（P=0.66，对数秩）。总之，Snail家族在影响患者生存的肺癌侵袭性方面发挥着重要作用，敲除该受体将会是肺癌靶向分子治疗的一种新选择。

3.2 ZEB家族 ZEB1、ZEB2同属于ZEB家族，是具有2个高度保守锌指结构域的转录因子，ZEB蛋白可通过抑制小 RNA（miRNA）-200（miR-200）家族表达来抑制上皮分化，而miR-200家族反过来也可以抑制ZEB蛋白，形成调节上皮细胞分化的重要双重负反馈循环。非小细胞肺癌中存在ZEB1、ZEB2的过表达，且发现异常表达的ZEB1与肺腺癌的肿瘤分级和肺鳞状细胞癌的淋巴或远处转移相关[13]，而ZEB2的完整性表达与肿瘤患者预后有直接关系。在MIYAHARA等[13]的报道中，多变量分析结果表明，弥漫性ZEB1表达是肺癌独立的不良预后因素，其与患者较短的无复发（P=0.034）和疾病特异性生存（P=0.031）显著相关。有报道称，接受辅助化疗的患者预后与未接受辅助化疗比较无显著差异，然而与23例辅助化疗患者的局部病灶表达相比，ZEB1的弥漫表达与不良预后显著相关[14]。在这一观点上，需要进一步研究ZEB1在多形性肺癌中的生物学功能及ZEB1表达导致患者预后差的机制。这表明ZEB1基因能作为多形性肺癌患者治疗的新靶点。

3.3 Twist EMT中的必需转录因子包括Twist1和Twist2，它们是基本的螺旋-环-螺旋转录因子，其结构域介导它们与DNA中靶基因的结合，促进或抑制几种基因的转录，并诱导上皮细胞向间叶细胞表型转变。Twist1的低表达可使N-钙黏蛋白、波形蛋白、β-连环蛋白和Sox2（NSC标志物）的表达降低，从而抑制EMT[15]。目前，Twist对肺癌的预后评估仍有争议。JIANG等[16]研究结果表明，在38%的患者中发现有Twist的高表达，且与Ⅰ期非小细胞肺癌患者较差的无复发生存期和总生存期相关。ZHOU等[17]研究结果显示，Twist阳性鳞状细胞癌患者的生存率明显低于Twist阴性患者，此外，在肺鳞状细胞癌和T1～2a期腺细胞癌的亚组分析中，发现Twist与肺鳞状细胞癌的不良预后相关，但与肺腺细胞癌无关。说明Twist的高表达并不是肺癌的一个独立预后因素。

3.4 波形蛋白波形蛋白是一种相对分子质量为57×103的蛋白质，是中间丝蛋白家族的主要成分，该蛋白能被β-链蛋白∕TCF反式激活，而增加肿瘤细胞的侵袭性。研究发现，波形蛋白在肺癌细胞系中的表达存在差异性，重组人聚ADP核糖聚合酶1（PARP1）能结合波形蛋白的启动子，并诱导其在肺癌细胞中的表达，而波形蛋白过表达是患者术后预后差的独立预测因子[18]。根据其在不同的癌细胞系和组织中的过度表达及其在癌细胞生长、侵袭和迁移中的相关性，表明波形蛋白实际上参与并促进肿瘤转移，并且可以作为癌症治疗的靶点。尽管有研究结果显示，某些药物可以降低波形蛋白水平，但这种影响总是被视为对波形蛋白表达的间接影响，这是因为多个EMT相关蛋白的表达减少。目前，很少有报道显示药物对波形蛋白表达有直接抑制作用。虽然大多数上皮细胞癌在EMT过程中表达波形蛋白，但波形蛋白的细胞外位置仍有待研究。

3.5 E-钙黏蛋白 E-钙黏蛋白是上皮组织中主要表达的一种Ⅰ型经典钙黏蛋白，也是形成细胞-细胞黏附型连接的关键成分，对维持组织完整性起重要作用。抑制E-钙黏蛋白表达的一个主要机制是Twist和Snail与E-钙黏蛋白启动子中的E-盒结合，低E-钙黏蛋白表达与高Twist表达相关，证明了Twist能直接调节E-钙黏蛋白的表达[19]。有研究报道了肺癌患者基因或表观遗传机制的丢失，常导致细胞E-钙黏蛋白功能或表达异常，而E-钙黏蛋白功能的丧失与患者的不良预后相关[20-21]，这一发现突出了E-钙黏蛋白在预测肺癌患者术后预后方面的价值。

4 miRNA与非小细胞肺癌的EMT

miRNA是由非编码的18～25个核苷酸组成的单链，以mRNA为目标进而降解和（或）抑制翻译来调节基因表达，导致蛋白质编码基因的部分或完全沉默。据报道，许多miRNA具有相似的肿瘤抑制作用，包括miR-138、miR-136和 miR-221等[22]。miR-200家族通过与ZEB1、ZEB2的相互阻遏作用调节EMT已得到广泛研究，吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞系与敏感的亲代细胞相比，其中miR-200的表达下调，并导致ZEB1、ZEB2转录因子的表达，促使细胞获得间充质表型、干细胞样特征和药物抗性[23]。其他miRNA家族还未像miR-200被广泛研究，但有证据表明它们参与了非小细胞肺癌细胞系和原发组织的EMT。在单个非小细胞肺癌患者队列（n=293）中，已证实26%的样本中miR-9家族的miRNA成员甲基化和转录沉默与EMT有关，且研究表明非小细胞肺癌细胞系中，miR-129-2的相关甲基化沉默可增加核因子（NF）-κB而促进EMT[24]。

5 EMT与NSCLC的药物抗性

有研究表明，EMT与化疗耐药性有关，敲除Snail或Twist，锌指转录因子和关键的E-钙黏蛋白阻遏物分子可导致EMT期间化疗敏感性的恢复[25]。目前，与EGFR相关的靶向药物（如厄洛替尼和吉非替尼）已被应用于晚期非小细胞肺癌的治疗，但很多患者在治疗数月内发生耐药现象。有研究学者常认为，非小细胞肺癌对EGFR药物的耐药与EGFR及其他基因突变有关，包括EGFR突变或活化替代的受体酪氨酸激酶如HER2、HER3、MET、IGF-1R 和 AXL 等。但也有研究发现，厄替尼治疗有效的肺癌患者中存在高水平表达的脯氨酸羟化酶3（PHD3），并进一步证明了TGF-β介导的PHD3失活能通过肺癌细胞中TGF-α∕EGFR信号通路而促进细胞的EMT和转移及对厄洛替尼的耐药性，诱导PHD3的再表达可抑制肿瘤转移并使细胞重新对药物敏感[26]。有研究发现，使用达沙替尼（ABL∕Src激酶抑制剂）单药治疗不能逆转肺腺细胞癌细胞中的EMT，但用厄洛替尼和达沙替尼进行组合治疗可以阻止EMT介导的肺癌耐药性，但具体机制尚不明确[27]。通过siRNA或使用蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT-1）抑制剂呋喃二脒敲低p120-catenin和PRMT-1表达，可增加肺癌细胞对厄洛替尼的敏感性，并可逆转EMT以克服酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的耐药性[28]。EMT介导的耐药性还与AXL受体酪氨酸激酶对下游信号通路的持续激活有关[29]，但目前对该通路在肿瘤细胞药物抗性方面的机制还有待充分阐明。SONG等[30]发现，通过条件激活Twist或重组 TGF-β来诱导EMT后，对EGFR-TKI下调EGFR磷酸化或下游致癌信号转导的能力（即PI3K∕Akt和 MEK∕ERK 途径）无影响。然而，EGFR-TKI诱导细胞凋亡的能力却显著下降，说明EMT在EGFR-TKI耐药中的独特地位。综上所述，EMT与EGFR-TKI的耐药性有密切关系。