灯盏花素对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡及NF-kB通路信号分子α7nAChR、p65、IkB-α的影响

丁丹，焦丽华，王雪臣，刘振宇，范立华，李庆海

心肌梗死是近些年导致我国居民死亡的主要原因。针对急性心肌梗死（AMI），临床多采用经皮冠状动脉介入术（PCI）、药物溶栓治疗或冠状动脉旁路移植术（CABG）以便恢复心肌再灌注，缩小梗死范围，这些措施明显提高了AMI的抢救成功率以及改善了患者预后[1]。但是心肌缺血再灌注（IR）损伤的存在降低了部分AMI的再灌注疗效[2]。研究表明，心肌细胞凋亡与心肌IR损伤显著相关，给予抗细胞凋亡干预可显著缩小心肌梗死范围，减轻再灌注损伤[3]。

灯盏花素是从中药灯盏花中分离得到的黄酮类化合物，具有扩张冠状动脉血管，增加冠状动脉血流量，改善局部血供等作用，临床多用于冠心病、心绞痛及急性心肌梗死的治疗[4]。但对于灯盏花素缓解心绞痛症状，改善心肌缺血的具体机制并未十分明确。胆碱能抗炎通路（CAP）是一种内源性神经反馈炎症调节机制，能通过传出迷走神经刺激而释放乙酰胆碱（ACh）并特异性结合α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR），并通过抑制NF-kB信号通路（NF-kB）抑制致炎细胞因子释放[5]。因此本研究拟建立大鼠体内心肌缺血再灌注（MIRI）损伤模型，观察灯盏花素对IR大鼠心肌细胞凋亡及α7nAChR、p65、IkB-α表达的影响，以期从胆碱能抗炎及NF-kB信号通路揭示灯盏花素防治心肌梗死的作用机制。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器原位末端标记（TUNEL）检测试剂盒及DAB显色试剂购自福建迈新公司产品。p65、IkB-α、β-actin以及α7nAChR鼠抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司。蛋白定量试剂盒购自中国碧云天公司。灯盏花素注射液购自吉林龙泰制药股份有限公司。Genios多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司；BIO- RAD电泳、转膜系统购自美国BIO- RAD公司；DU730紫外可见分光光度计购自美国 Beckman公司；PM- 10AD倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；ChemiDoc TM XRS+凝胶成像仪器购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验动物及分组健康SD大鼠40只，体量为220±20g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将以上大鼠随机分为四组：假手术组、缺血再灌注组、灯盏花素低剂量（25 mg/kg·d）组和灯盏花素高剂量组（50 mg/kg·d）各10只。4组均制备 MIRI 模型，其中灯盏花素预处理组，于术前分别连续1周腹腔注射灯盏花素；假手术组以及缺血再灌注组分别注射等量的生理盐水。

1.3 缺血再灌注大鼠模型（MIRI）的制备以上各组大鼠经腹腔注射10%乌拉坦麻醉(1ml/100 g)，采用仰卧位固定大鼠，并使用用针型电极插入四肢皮下记录标准肢体Ⅱ导联心电图。于胸骨左缘3～4肋间采用左胸正中旁切口开胸，暴露心脏，在左心室与肺动脉干之间结扎左冠状动脉前降支，同时在结扎线与血管之间穿一直径为2 mm、长为5 mm的硅胶管，结扎30 min; 然后剪断缝合线，取出硅胶管，再灌注2 h。假手术组仅分离前降支，不结扎。以收紧结扎线后动物的心电图标准导联 ST-T段抬高，放松后抬高的ST-T下降1/2以上为MIRI模型建立成功[6]。

1.4 各组大鼠心肌组织梗死面积的检测以上各组大鼠于建立MIRI模型后，同样经腹腔注射10%乌拉坦麻醉，开胸取出心脏。各组大鼠部分心脏组织于-20℃冷冻30 min后，沿心脏左心室长轴，每隔1 mm切取1 mm厚的切片数张，置于1% TTC溶液中、37℃避光孵育15 min，正常组织呈红色、梗死区呈灰白色，通过BI- 2000医用图像分析系统计算心肌组织梗死面积（梗死面积/视野面积）[7]。

1.5 TUNEL法检测心肌细胞的凋亡取以上各组大鼠制备的组织切片，按照TUNEL染色试剂盒方法步骤，通过光学显微镜观察各组大鼠心肌细胞凋亡状况（胞核黄染为阳性着色）；每只大鼠取5张切片，每张切片随机选取10个视野，测定阳性染色平均光密度值以及阳性染色面积率，计数细胞总数及阳性细胞数，然后计算心肌细胞凋亡指数：凋亡指数=（阳性细胞数/细胞总数）×100%[8]。

1.6 蛋白印记法检测α7nAChR、p65、IkB-α蛋白的表达准确称取以上各组大鼠的心肌组织100 mg，在冰块上剪碎后迅速移入组织破碎仪中，并加入400 μl 4℃预冷的总蛋白提取液，随后转入1.5 ml EP管中冰浴30 min，并于4℃，10 000 r/min离心机中离心10 min，随后取上清，参照试剂盒说明用Bradford方法测定总蛋白浓度，并统一调整蛋白浓度为5 μg/ml。

随后抽取以上各组大鼠20 μl蛋白变性后上样，于质量分数为12%的十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳后，电转至硝酸纤维膜，随后加入鼠抗人单克隆α7nAChR、p65、IkB-及β-actin一抗、辣根过氧化物酶标志鼠抗兔二抗，化学底物发光法显色，图像扫描分析。显影的条带采用 Image-QuaNT软件测量其光密度,以各β-actin为内参，计算各组蛋白相对光密度值[9]。

1.7 统计学处理采用SPSS 21.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用one-way ANOVA检验，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05则认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织梗死面积的比较与假手术组比较，缺血再灌注组心肌梗死面积显著增加（P＜0.01），表明所建立MIRI模型成功；灯盏花素高低剂量组较缺血再灌注组心肌梗死面积显著减少（P＜0.05），并且灯盏花素高剂量组较低剂量组心肌梗死面积仍显著减少（P＜0.05），表明灯盏花素有效降低了MIRI模型大鼠心肌梗死面积并且灯盏花素高剂量组疗效优于低剂量干预组（表1）。

2.2 各组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较与假手术组比较，缺血再灌注组阳性染色面积率以及心肌细胞凋亡指数显著增加（P＜0.01）；灯盏花素干预组较缺血再灌注组染色面积率以及心肌细胞凋亡指数显著减少（P≤0.05，且灯盏花素高剂量干预组较低剂量干预组染色面积率以及心肌细胞凋亡指数仍显著减少（P≤0.05，表明灯盏花素有效降低了MIRI模型大鼠心肌凋亡指数并且灯盏花素高剂量组在降低心肌凋亡指数方面要优于低剂量组（表2，图1）。

表1 各组大鼠心肌组织梗死面积的比较

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡指数的变化

图1 各组大鼠心肌细胞凋亡指数的变化（与假手术组比较，**P＜0.01；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05；与缺血再灌注组比较，##P＜0.01；与灯盏花素低剂量组比较，&P＜0.05）

2.3 各组大鼠心肌组织p65蛋白表达的比较与假手术组比较，缺血再灌注组p65蛋白表达显著降低（P＜0.01）；灯盏花素干预组较缺血再灌注组p65蛋白表达显著增加（P＜0.05），并且灯盏花素高剂量干预组较低剂量干预组p65蛋白表达显著增加（P＜0.05），以上结果表明MIRI缺血再灌注损伤大鼠p65蛋白显著减少，并且灯盏花素的干预显著增加了MIRI缺血再灌注损伤大鼠p65蛋白的表达量（图2）。

2.4 各组大鼠心肌组织IkB-α蛋白表达的比较与假手术组比较，缺血再灌注组IkB-α蛋白显著增加（P＜0.01）；灯盏花素干预组较缺血再灌注组IkB-α蛋白表达显著降低（P＜0.05），并且灯盏花素高剂量干预组较低剂量干预组IkB-α蛋白表达显著降低（P＜0.05），以上结果表明MIRI缺血再灌注损伤大鼠IkB-α蛋白显著增加，并且灯盏花素的干预显著降低了MIRI缺血再灌注损伤大鼠IkB-α蛋白的表达量（图3）。

图2 各组大鼠心肌组织p65蛋白表达的比较

2.5 各组大鼠心肌组织α7nAChR蛋白表达的比较与假手术组比较，缺血再灌注组α7nAChR蛋白显著降低（P＜0.01）；灯盏花素干预组较缺血再灌注组α7nAChR蛋白表达显著增加（P＜0.05），并且灯盏花素高剂量干预组较低剂量干预组α7nAChR蛋白表达显著增加（P＜0.05），以上结果表明MIRI缺血再灌注损伤大鼠α7nAChR蛋白显著降低，并且灯盏花素的干预显著增加了MIRI缺血再灌注损伤大鼠α7nAChR蛋白的表达量（图4）。

3 讨论

图3 各组大鼠心肌组织IkB-α蛋白表达的比较

冠心病（CHD）是全球死亡和致残的主要原因。根据世界卫生组织的数据，每年全球死亡人数约为7 254 000人（占所有死亡人数的12.8%）。冠心病的影响多数归因于急性心肌缺血[10]。它通常出现在急性ST段抬高心肌梗死（STEMI）的患者中，而减少急性心肌缺血性损伤和心肌梗塞（MI）的最有效的治疗是及时使用溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗（PCI）增加心肌再灌注[11]。然而心肌再灌注过程本身可诱导进一步的心肌细胞凋亡，并且尚无有效的预防心肌再灌注损伤的治疗方法，因此更及时和有效的药物支持来改善再灌注损伤成为研究的重点。

图4 各组大鼠心肌组织α7nAChR蛋白表达的比较

灯盏花素又名野黄芩甙元，是中药灯盏的有效成分，为较强的非竞争性蛋白激酶C（PKC）抑制剂。多种体内和体外研究的证据表明，灯盏花素具有广泛的心血管药理作用，包括血管舒张，防止局部缺血/再灌注损伤（I/R），抗炎，抗凝，抗血栓形成，内皮保护，心肌保护，减少平滑肌细胞迁移和增殖等作用[12,13]。本研究显示，灯盏花素可以有效降低MIRI模型大鼠心肌梗死面积以及心肌凋亡面积和指数并且具有一定的剂量依赖性，这将为灯盏花素应用于心肌梗死患者提供了有效的实验依据。

同时相关研究表明灯盏花素对心血管缺血的保护作用以及灯盏花素对心肌细胞凋亡的影响可能涉及多种机制，包括干扰调节某些基因表达的特定途径和激活相关的ATP酶[14]。相关研究显示灯盏花素可能通过PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制心肌细胞的凋亡从而对心肌梗死I/R损伤提供有效的保护作用[15]。此外另一项研究表明，灯盏花素可以抑制IL-18和ICAM-1在肺部的表达，从而免受炎症级联反应的影响[16]；另外，灯盏花素可通过降低心肌ICAM-1蛋白表达，增加Na+-K+-ATP酶，Mg2+-ATP酶，Ca2+-ATP酶在心肌线粒体中的表达，从而增加氧自由基清除发挥心肌的保护作用[17]。

在各种刺激因素作用下，迷走神经通过胆碱能抗炎通路促使主要神经递质乙酰胆碱大量释放，从而抑制巨噬细胞活化，抑制促炎因子生成和释放，最终抑制局部或全身的炎症反应[18]。CAP是一种内源性的神经反馈调节机制，从α7nAChR被激活起至发挥抗炎作用主要是通过两大信号通路：抑制核转录因子NF-κB通路和激活Janus激酶2及信号转导子和转录激活子3（Jak2/STAT3）通路[19]。其中NF-κB 是I/R损伤过程中较早参与的一个调节蛋白，能调节多种参与I/R 损伤的细胞因子、炎性介质、粘附分子的基因转录过程，从而控制它们的生物合成。

NF-kB是近年研究较热的一个基因转录调控蛋白，它广泛地参与细胞生长、分化、免疫和炎症反应，产生抗凋亡、促增殖的作用，是细胞重要的信号传递通路，可通过调节一系列基因转录、表达而发挥其抗凋亡作用。研究表明，NF-kB-p65蛋白以及其抑制性蛋白IkB-α在炎症反应、细胞增殖凋亡乃至肿瘤的发生中发挥着重要的作用。本研究表明，MIRI缺血再灌注损伤大鼠p65蛋白和α7nAChR蛋白显著减少，IkB-α蛋白显著增加；并且灯盏花素的干预显著增加了MIRI缺血再灌注损伤大鼠p65和α7nAChR蛋白的表达量，降低了IkB-α蛋白的表达量。因此灯盏花素通过CAP介导的NF-kB通路有效介导了抑制心肌细胞凋亡。

综上所述，胆碱能抗炎以及NF-kB通路在心肌缺血再灌注损伤的形成过程中有重要的作用，并且灯盏花素可通过CAP调节下的NF-kB通路有效发挥了抑制心肌细胞凋亡的功能。