海绵共附生真菌ＦＷＺ０４１５代谢产物的研究

钱纯果 周义权 杨曦亮 李奎 石丽桥

摘要：对海绵共附生真菌FWZ0415进行固体发酵培养，并对其发酵培养物的次级代谢产物进行分离纯化和结构鉴定等方面的研究。运用常压硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱（Sephadex LH-20）和半制备高效液相色谱（HPLC）等手段，从该菌株固体发酵培养物的提取物中分离纯化得到两个化合物，并运用核磁共振1H NMR、13C NMR等手段鉴定这两个化合物的结构为violaceol-I和violaceol-II。测试这两个化合物对肿瘤细胞系K252、MCF-7、SGC7901的细胞毒性，violaceol-I未见显著的细胞毒性（IC50>30 μmol），violaceol-II对3株肿瘤细胞系的IC50分别为16.7、16.3、15.8 μmol。

关键词：海绵共附生真菌;次生代谢产物;分离纯化;结构鉴定;抗肿瘤活性

中图分类号：R284;R285         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）22-0064-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.018           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Sponge epiphytic fungi FWZ0415 was cultured in solid state fermentation，and its secondary metabolites were isolated，purified and identified. Using silica gel column chromatography，Sephadex column（Sephadex LH-20） and the preparation of semi preparative high performance liquid chromatography（HPLC） methodtwo compounds were purified，and then identified as violaceol-I and violaceol-II by nuclear magnetic resonance 1H-NMR and 13C-NMR. The cytotoxicity of two compounds to K252，MCF-7 and SGC7901 were tested，violaceol-I was not significantly cytotoxicity（IC50>30 μmol）. The IC50 of violaceol-II to three tumor cell lines were 16.7，16.3，15.8 μmol，respectively.

Key words： spongye epiphytic fungi; secondary metabolites; isolation and purification; structural identification; antitumor activity

海綿是迄今为止最丰富的海洋天然产物的来源，已经发展到1万多种，占海洋动物种类的1/15。近年的研究表明，先前从海绵中提取得到的活性物质，其真正的来源是海绵共生、寄生、附生的微生物[1]。海绵共附生微生物附着在海绵表面或者内腔表面，随意性比较大，会随着海水的流动产生很大变化。而且海洋中特殊的高盐、高压、低温、低光照的生存条件，也催生了一些与陆地微生物代谢方式不同的微生物[2]。研究海绵微生物并分离纯化其次级代谢产物可作为开发海绵天然产物的重要途径，并且为解决活性天然化合物药源问题提供了可行方案[3]。

运用常压硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱（Sephadex LH-20）和半制备高效液相色谱（HPLC）等手段，从海绵共附生真菌FWZ0415固体发酵培养物的提取物中分离纯化得到了两个化合物，鉴定其结构，并考察两个化合物对3株肿瘤细胞系K252、MCF-7、SGC7901的毒性。

1  材料与方法

1.1  菌种

菌株由中国科学院南海海洋研究所林秀萍实验员从海绵样品（编号为XWS04）分离得到，该样品于2016年采自广东省徐闻县海域。菌种现保存在湖北省生物农药工程研究中心，菌种编号FWZ0415。

1.2  仪器设备与试剂

核磁共振波谱仪Bruker AM-500 MHz;高效液相色谱仪为HITACHI公司的L-2130泵、L-2400检测器的HPLC;循环水真空泵SHZ-CB型为巩义市予华仪器有限公司产品;硅胶（100-200目）为青岛海洋化工厂产品;葡聚糖凝胶Sephadex LH-20由Phamacia公司生产;石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮（分析纯）产自天津市富宇精细化工有限公司;氘代试剂DMSO是Carmbridage Isotope Laboratories公司产品。

1.3  菌株FWZ0415 的固体发酵培养

将在MB（麦芽浸膏15 g，粗海盐10 g，琼脂粉15 g，去离子水1 000 mL，pH 7.4～7.8）上培养10 d的平板菌种选取长势良好的部分，切下约0.5 cm×1.0 cm大小的培养基块，转接至装有MB液体种子培养基的100 mL三角瓶中，于25 ℃、180 r/min摇床培养48 h。将种子液转接于大米固体培养基（大米200 g，粗海盐2 g，自来水200 mL，装于1 000 mL三角瓶）中，于25 ℃静置培养。36 d后终止发酵，获得42瓶培养物。

1.4  菌株FWZ0415次级代谢物的提取

大米固体发酵培养基用丙酮浸泡过夜，搅拌粉碎，超声10 min。将提取物进行抽滤，除去丙酮，水溶液用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层。大米固体发酵培养物残渣用乙酸乙酯浸提3次，抽滤，收集乙酸乙酯滤液。合并乙酸乙酯溶液，减压旋转蒸馏，获得粗浸膏。用甲醇溶解粗浸膏，然后用石油醚萃取3次，将甲醇层回收，合并，蒸馏除去甲醇，最后共得到浸膏136.1 g。

1.5  菌株FWZ0415次级代谢物的分离纯化

将乙酸乙酯浸膏硅胶拌样，装柱。以石油醚-氯仿（1∶1）、氯仿-甲醇（1∶1）梯度洗脱总共得12个馏分。第10组分用甲醇溶解后，过葡聚糖凝胶柱，洗脱溶剂为甲醇，共得到8个馏分。将第4组分用55%水-甲醇系统进行HPLC半制备分离，流速3.0 mL/min，得到两个单体化合物，化合物1和化合物2。

1.6  化合物细胞毒性测试

收集对数生长期细胞，调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板，每孔加100 μL细胞悬液。细胞在37 ℃、100%相对湿度、5% CO2培养箱中孵育24 h。用培养基将待测化合物稀释至合适的作用浓度，按25 μL/孔加入细胞。细胞置于37 ℃、100%相对湿度、5% CO2培养箱中孵育72 h。吸弃培养基，加入含10% CCK-8的新鲜完全培养基置于37 ℃培养箱中孵育2～4 h。测定450 nm波长处的吸光度，以650 nm处吸光度作为参比，计算抑制率及IC50。

2  结果与分析

2.1  化合物结构鉴定

化合物1为淡黄色油状物;硫酸香草醛显红色，分子式C14H14O5，结构式见图1。此化合物的波谱数据（表1）与文献[4]中的已知化合物violaceol-I一致，化合物1鉴定为violaceol-I。

化合物2为淡黄色油状物，硫酸香草醛显红色，分子式C14H14O5，结构式见图1。此化合物的波谱数据（表1）与文献[4]中的已知化合物violaceol-II一致，化合物2鉴定为violaceol-II。

2.2  细胞毒性

共培养72 h后，测试化合物1和化合物2对肿瘤细胞系K252、MCF-7、SGC7901的细胞毒性。结果（表2）表明，violaceol-I未见明显的细胞毒性（IC50>30 μmol），violaceol-II对3株肿瘤细胞系的IC50分别为16.7、16.3、15.8 μmol。

3  讨论

目前，从海绵共附生微生物中分离出的不少结构新颖的化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗虫、抗炎等多种生物活性[5-8]。研究的海绵共附生真菌FWZ0415培养特征较特殊，其次级代谢产物非常丰富，因此对其进行次生代谢产物研究，得到两个单体化合物，经鉴定分别为violaceol-I、violaceol-II。这两个化合物最早由Yamazaki等[9]于1981年从真菌Emericella violacea的代谢产物中分离得到，并具有微弱的抗菌活性。进一步的研究表明，这类化合物对氧化磷酸化具有解偶联作用，但是其作用会随化合物的降解逐渐减弱消失[10]。Asami等[11]发现violaceol是激动蛋白的抑制剂，可以诱导呈纤维细胞形状延伸，可能具有抗肿瘤活性。有文献报道其对Aβ42有显著的抗聚集活性[4]，IC50分别为5.1、2.3 μmol，该化合物可能可以用于阿尔兹海默症的治疗。在本试验中，测试了化合物细胞毒性，化合物2显示具有明显的细胞毒性。在下一步的研究中，将测试其在农业领域方面的应用。

参考文献：

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