真菌ＮＢＥＲＣ－１７０３０１中农药活性化合物的研究

张亚妮 方伟 王开梅 张志刚 王燕 万中义 吴兆圆

摘要：筛选到一株具有农药活性的真菌NBERC-170301，通过活性跟踪，确定出其中的活性组分。并经过大量发酵，提取分离得到4个化合物，经超高效液质联用（UPLC-MS）和NMR确定其中3个化合物分别为青霉酸、郝金青霉素和郝青霉素酮，活性测试结果表明，化合物4对小菜蛾具有较好的毒杀活性，但结构暂未确定。

关键词：真菌NBERC-170301;农药活性;青霉酸;郝金青霉素;郝青霉素酮

中图分类号：TQ450.1        文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）22-0060-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.017           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Fungus NBERC-170301 which had pesticide activity was found. By active tracking，the active fractions were detected，and 4 compounds were obtained（1-4）. Compounds 1-3 were identified as penicillic acid（1），herqueichrysin（2） and herqueinone（3） by UPLC-MS and NMR. The results of biological activity showed that compound 4 had insecticidal activity against the Plutella xylostella L.，however，the structure of which was failed to be identified.

Key words： fungus NBERC-170301; pesticide activity; penicillic acid; herqueichrysin; herqueinone

真菌分布广泛，从陆地到海洋，从动物到植物，乃至其他微生物，幾乎都有真菌的存在。正是由于真菌的物种多样性与生态环境的多样性导致了其次生代谢产物结构和生物活性的多样性，因而一直以来都是先导化合物的重要来源之一[1，2]。据不完全统计，已有8 600多种活性代谢产物分离自真菌，具有多种结构类型。从1940年的仅10多个化合物到2002年超过22 000个化合物，期间具有活性代谢产物的数量呈指数倍地不断增长[3]。临床上广泛使用的青霉素、洛伐他汀、环孢素以及棘白霉素等药物，都是真菌次生代谢产物或其衍生物[4]。

湖北省生物农药工程研究中心拥有丰富的微生物资源，在抗菌活性真菌的筛选过程中，筛选到一株具有农药活性的真菌NBERC-170301，通过活性跟踪，确定出其中的活性组分。现将试验报告如下。

1  材料与方法

1.1  菌株

1.1.1  抗生素产生菌  编号为真菌NBERC-170301，在武汉市的土样中分离得到，由湖北省生物农药工程研究中心保存。

1.1.2  生测指示菌  番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、小麦颖枯病菌（Septoria nodorum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）均为湖北省生物农药工程研究中心保存。

1.1.3  供试昆虫  小菜蛾（Plutella xylostella L.）初孵幼虫、棉铃虫（Helicoverpa armigera）初孵幼虫、蚜虫（Aphidoidea）均由湖北省生物农药工程研究中心提供。

1.2  培养基

1.2.1  种子培养基  麦芽糖6.25 g，麦芽提取物6.25 g，酵母提取物1.00 g，磷酸二氢钾1.25 g，硫酸镁0.625 g，蛋白胨0.625 g，琼脂粉15.00 g，去离子水1 000 mL。

1.2.2  发酵培养基  葡萄糖72.00 g，蛋白胨8.00 g，酵母提取物4.00 g，磷酸二氢钾2.00 g，硫酸镁1.00 g，盐酸硫胺0.10 g，pH 6.0，去离子水1 000 mL。

1.2.3  生测培养基  采用（PDB+琼脂）半固体培养基，马铃薯（去皮）200 g， 葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，去离子水1 000 mL，自然pH。

1.3  仪器与试剂

1.3.1  仪器  Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振仪（TMS为内标）（德国Bruker BioSpin公司）;BUCHI ROTAVAPOR R-200型旋转蒸发仪（瑞士）;Water 2695高效液相色谱仪（Waters 2996二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4.0）;高效制备液相色谱仪（Waters2525泵，带2767自动收集系统，Waters2996二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4.0）;液质联用仪：Waters 2695高效液相色谱系统，美国Micromass Quattro Micro？誖质谱仪电喷雾离子源（ESI），Masslynx V4.1液质联用分析软件。

2.3  化合物的活性测试

按照“1.5.5”的方法对4个化合物进行杀虫、杀菌的活性测试。化合物1在浓度20 mg/L下仅对水稻纹枯病原真菌具有较弱的抑制作用，但无杀虫活性。化合物2、化合物3在3个浓度梯度下均无杀虫、杀菌活性。化合物4在浓度1 000 mg/L、500 mg/L下对小菜蛾具有较好的毒杀活性，但对棉铃虫和蚜虫无活性，且无杀菌活性。

3  小结与讨论

筛选到一株活性真菌NBERC-170301，经分离纯化得到4个化合物，通过NMR数据分析，确定其中的3个化合物分别为青霉酸[Penicillic acid（1）]、郝金青霉素[Herqueichrysin（2）]和郝青霉素酮[Herqueinone（3）]，化合物3以一对构象异构体呈现。化合物4对小菜蛾具有较好的毒杀活性。

青霉酸主要是由软毛青霉、圆弧青霉、马顿青霉、托姆青霉、徘徊青霉、棒形青霉以及棕曲霉等产生的多聚乙酰类霉菌毒素。有关青霉酸的研究较多，青霉酸不仅具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤以及抑制乙酰胆碱酶的活性，且对各种动物都具有毒性，主要引起心脏、肝脏和肾脏等器官的损伤，并具有潜在致癌性[11-13]。此外，青霉酸是一种真菌群体效应抑制剂（QSI），近期人们对50种青霉属真菌进行筛选，发现66%的菌株能产生具有QSI活性的次生代谢产物，其中的两种主要次生代谢产物为青霉酸和棒曲霉素，以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为例，青霉酸和棒曲霉素能够对铜绿假单胞菌中群体效应控制的基因进行抑制，其中青霉酸的抑制率高达60%[14]，考慮到青霉酸本身的毒性，或许进行修饰变成无毒的衍生物之后可以成为抗感染的药物。郝金青霉素是一种新的芴酮抗生素，Narasimhachari等[8]研究表明，郝金青霉素在青霉属Penicillinm herquei strain I菌株静止培养的菌丝体中分离得到;浓度为1 μg/mL时可抑制枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌生长。有关郝青霉素酮的研究报道较少。活性测试结果表明，化合物4对小菜蛾具有较好的毒杀活性，但其结构中所含手型分子暂未确定，进一步将会继续对化合物4进行结构分析，以便找到活性好的化合物。

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