茶树CsLEA5基因的克隆及表达分析

任 燕，高 童，陈江飞，杨建坤，黄慧宇，王伟东*

(1 西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨陵 712100；2 宜宾学院 川茶学院，四川宜宾 644000)

植物在生长发育过程中经常遭受各种环境胁迫的影响，与之进化形成的胁迫应答机制是其产生适应性和抗逆性的关键。其中，胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA prorein)作为一类高亲水性蛋白在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。LEA蛋白最早在棉花子叶中被发现，因其在种子胚胎发育后期大量积累而得名[1]，之后大量LEA蛋白及其编码基因在大麦、小麦、水稻、玉米、葡萄、大豆等高等植物中被鉴定[2]，并根据Pfam结构域类型将植物中LEA蛋白分为LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、LEA_6、Dehydrin和SMP(Seed Maturation Protein)8个亚家族[3]。同时，越来越多的研究证实LEA蛋白除种子外在根、茎、叶、花粉管等组织器官中亦广泛存在[4]，且它们大多受干旱、极端温度、高渗透、高盐、ABA、紫外辐射等环境胁迫所诱导，在植物响应各种环境胁迫过程中发挥重要作用[5-6]。例如，过表达大麦HVA1基因(属于LEA_3亚家族蛋白基因)能够显著提高转基因小麦和水稻对干旱胁迫耐受性[7]；同样地，过表达柑橘LEA蛋白编码基因CuCOR19，亦使转基因烟草的抗寒性显著增加[8]。最近，Saha等[9]研究表明过表达拟南芥AtLEA4-1，可以显著增加转基因芥菜对干旱和盐胁迫的耐受性；Liu等[10-11]则证实玉米ZmLEA5和ZmLEA3的表达，均可有效提高转基因烟草的抗寒性；另外，谷子SiLEA14、花生AdLEA5、西瓜ClLEA3-1、多毛番茄ShDHN及苔藓PpLEA3，相继被证实在提高植物体对不同非生物胁迫耐受性过程中发挥重要作用[12-16]。目前，LEA蛋白在逆境胁迫下的生物学功能及分子调控机制受到越来越多的关注。

茶树[Camelliasinensis(L.)O. Kuntze]作为一种重要的叶用经济作物，在世界范围内具有较广泛的栽培种植。然而，茶树生长过程中经常遭遇各种环境胁迫，其中低温和干旱胁迫是影响茶树生长发育及茶叶产量和品质的重要因子，严重制约着茶产业的发展[17]。最近，Muoki等[18]发现茶树中一个LEA3类似蛋白在环境胁迫下被上调表达；Paul等[19]则发现茶树CsLEA7所编码蛋白作为分子伴侣增加了大肠杆菌对不利环境的耐受性；而李叶云等[20]的研究表明，茶树脱水素基因(CsDHN)可能在防御非生物逆境胁迫和参与种子成熟脱水的活力保护过程起一定作用。类似的研究发现[21]，茶树干旱胁迫转录组分析中一个LEA基因(基因ID为Unigene47064_All，CsLEA5)被显著上调表达，推测其可能在茶树胁迫应答过程中发挥重要作用。

本研究以茶树‘龙井长叶’为材料，克隆获得了CsLEA5基因的cDNA全长序列，利用生物信息学初步分析了该基因及其编码蛋白的结构和功能，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了CsLEA5基因在不同组织及低温、干旱胁迫下的表达模式，以期为探讨该基因逆境胁迫下的生物学功能奠定基础，为茶树抗逆分子遗传育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 植物材料及处理

试验所用材料茶树‘龙井长叶’(C.sinensiscv. ‘Longjingchangye’)为长势一致的2年生扦插穴盘苗，其在人工气候培养箱中的培养条件为：昼夜温度28 ℃/22 ℃，光周期12 h/12 h，光照强度240 μmol·m-2·s-1，相对湿度70%～80%。经1个月预培养后，将茶苗随机分成2组，一组在4 ℃人工气候培养箱中进行低温胁迫处理，另一组将茶苗连同穴盘一起放置于含20% PEG 6000溶液的周转箱中，使根系完全被浸泡其中以模拟干旱胁迫，其它培养条件不他，每个处理设3个重复。分别于0、1、2、3、4、8、12、24和48 h取芽下第二叶0.1 g，液氮速冻后于-80 ℃保存备用。

分别取未处理‘龙井长叶’茶苗的根、嫩茎、嫩叶和初开的花朵各0.1 g，置于液氮中速冻，-80 ℃保存，用于基因的组织特异性表达分析。

1.2 方 法

1.2.1茶树总RNA提取及反转录采用CTAB法提取茶树叶片和其他组织材料的总RNA[22]，利用NanoDrop 2000c(Thermo，美国)检测RNA浓度与质量，并用1%变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用5×All-In-One RT MasterMix试剂盒(ABM，加拿大)反转录获得cDNA第一链，用于基因克隆与荧光定量PCR分析。

1.2.2CsLEA5基因全长cDNA的克隆根据茶树‘龙井长叶’转录组库(NCBI SRA：SRP128078)中序列信息，利用IDT(http://sg.idtdna.com/calc/analyzer)在线软件设计特异性引物(表1)，以‘龙井长叶’茶树叶片cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为：2×Taq Master Mix 25 μL，cDNA模板5 μL，上下游引物各2.5 μL，ddH2O补齐至50 μL，程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经凝胶电泳检测后用Gel Extraction Kit(OMEGA，美国)试剂盒进行回收，回收产物连接至pMD19-T载体(TaKaRa，大连)，转入DH5α感受态细胞后送杨凌奥科生物科技有限公司测序。

1.2.3CsLEA5基因生物信息学分析用BioXM 2.6软件进行基因开放阅读框查找和翻译，用NCBI中的Blast工具预测编码蛋白保守结构域，用MEGA 6.0软件进行多序列比对并构建系统发育树，用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/#TOP)预测编码蛋白的分子量、理论等电点等理化性质，用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测编码蛋白磷酸化位点，用ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)预测编码蛋白亲/疏水性，用TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)预测编码蛋白跨膜结构域，用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽，用WoLF PSORT(http://wolfpsort.org/)预测编码蛋白的亚细胞定位。

1.2.4CsLEA5基因启动子序列分析以CsLEA5基因cDNA序列为探针与茶树基因组数据[23]进行本地Blast比对，确定CsLEA5基因位置，进而获得起始密码子上游1 500 bp启动子序列。用PlantCARE在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析。

表1 引物序列

1.2.5CsLEA5基因的表达分析根据基因的全长序列在非保守区域设计实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物(表1)，以茶树CsPTB1为内参基因[24]，按照SYBR®PremixExTaqⅡ(TaKaRa，大连)的说明书对CsLEA5基因进行qRT-PCR分析。PCR 反应体系为：SYBR®PremixExTaq10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1μL, RNase free H2O 补至总体积20 μL。在IQ5 Multi-Color Real time PCR Detection System(Bio-Rad，美国)上进行PCR反应，反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min 30 s，40个循环；熔解曲线程序采用60 ℃ 30 s，每个循环增加0.5 ℃，71个循环。每个样品重复3次，数据结果采用2-ΔΔCT算法进行分析[25]。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010和SPSS 20软件进行数据整理和统计学分析，用Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 CsLEA5基因克隆与序列分析

以茶树‘龙井长叶’叶片cDNA为模板，用特异性引物进行RT-PCR扩增，获得一条大小为515 bp特异片段(图1)，测序结果显示其包含一个375 bp开放阅读框，编码124个氨基酸，与转录组检索序列一致，为CsLEA5基因cDNA全长序列，GeneBank登录号为MK050967(图2，A)。编码蛋白序列比对结果显示，CsLEA5含有一个典型的LEA_3保守结构域(Pfam03242)，属于LEA蛋白的LEA_3亚家族成员(图2，B)。

2.2 系统进化树分析

利用MEGA 6.0对19个不同植物的LEA5蛋白构建系统进化树(图3)，结果显示CsLEA5与醉蝶花、拟南芥、亚麻荠和藜麦中的LEA5亲缘关系较近，推测其具有类似的起源和进化关系。另外，除同一科植物LEA5蛋白一致性较高，不同物种间LEA5蛋白一致性整体较低。

M. DNA marker；1. 退火温度56 ℃；2. 退火温度58 ℃图1 茶树CsLEA5基因PCR扩增结果M. DNA marker；1. Annealing temperature 56 ℃； 2. Annealing temperature 58 ℃Fig.1 PCR application of CsLEA5 gene

图2 CsLEA5基因的cDNA及编码氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of CsLEA5 gene

图3 CsLEA5与其他植物LEA5蛋白的系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis among CsLEA5 and LEA5 proteins of other plants

2.3 CsLEA5蛋白的生物信息学分析

2.3.1蛋白理化性质预测蛋白理化性质分析结果显示，CsLEA5蛋白的分子式为C587H933N171O191S3，分子量为13.5 kD，理论等电点为5.92，有负电荷残基(Asp + Glu)16个，正电荷残基(Arg + Lys)13个，不稳定系数为39.22，推测CsLEA5为稳定的酸性蛋白。

2.3.2磷酸化位点与亲/疏水性分析磷酸化位点分析结果如图4，A所示，CsLEA5含多个磷酸化位点，其中以丝氨酸磷酸化位点最多，且多个位点的预测值在0.90以上，表明其很有可能受到磷酸化作用的调控。另外，亲/疏水预测结果显示CsLEA5的亲水区域显著大于疏水性区域，GRAVY值为-0.469，表明其属于亲水性蛋白(图4，B)。

2.3.3跨膜结构域分析跨膜结构预测结果显示，CsLEA5蛋白在11～31位氨基酸处存在一个由外向内的跨膜螺旋，加权平均分为518(大于模型设定值500)，推测其是一个跨膜蛋白(图5)。同时，SignalP预测结果显示CsLEA5没有信号肽，属于非分泌蛋白。另外，亚细胞定位预测结果显示，CsLEA5定位于线粒体或叶绿体中。

2.4 CsLEA5基因启动子顺式作用元件分析

启动子顺式作用元件预测结果如表2所示，CsLEA5基因启动子除包含转录相关的一般元件外，还包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件，如厌氧诱导元件(ARE)、乙烯响应元件(ERE)、胁迫响应元件(STRE)、创伤响应元件(WUN-motif)及MYB和MYC转录因子识别位点。

图4 CsLEA5磷酸化位点与亲/疏水性分析Fig.4 Phosphorylation site prediction and hydrophilicity /hydrophobicity analysis of CsLEA5

2.5 CsLEA5基因的表达分析

2.5.1组织特异性表达分析qRT-PCR结果(图6)显示，CsLEA5基因在叶片中的表达量最高，茎中次之，而在根和花中的表达量较低，其表达具有明显的组织特异性。

2.5.2低温和干旱胁迫下的表达分析低温胁迫下，茶树叶片中CsLEA5基因的表达量爆发式增加，在4 h达到最高，为对照的80多倍，之后开始逐渐降低，于48 h降至对照水平，整体呈现出先上升后降低的变化趋势(图7)，表明低温胁迫显著诱导了茶树叶片中CsLEA5基因的表达。干旱胁迫下，茶树叶片中CsLEA5基因的表达量逐渐增加，在2 h达到峰值，后逐渐降低到较低的水平，之后又逐渐增加，整体呈现先升高后降低再升高的变化趋势(图7)，表明CsLEA5基因同样受到干旱胁迫诱导表达。

图5 CsLEA5跨膜结构域分析Fig.5 Transmembrane domains analysis of CsLEA5

元件Element数量Amount序列Sequence功能FunctionAC-I1TCACCCACCCACC 光响应元件Light responsive elementARE2AAACCA厌氧诱导元件Essential for the anaerobic inductionAT-rich element2ATAGAAATCAADNA结合蛋白的结合位点Binding site of DNA binding protein (ATBP-1)Box-47ATTAAT光响应元件Part of a conserved DNA module involved in light responsivenessCAAT-box19CAAT启动子和增强子区域共有元件Common element in promoter and enhancer regions CCAAT-box1CAACGGMYBHv1结合位点MYBHv1 binding siteERE6ATTTTAAA 乙烯响应元件Ethylene responsive elementGA-motif2ATAGATAA 光响应元件Part of a light responsive elementMYB recognition site 1CCGTTGMYB识别位点MYB recognition siteMYC2CAATTG/CATGTGMYC识别位点MYC recognition siteSTRE2AGGGG胁迫响应元件Stress responsive elementTATA-box22TATA核心启动元件Core promoter elementWUN-motif1AAATTTCCT 创伤响应元件Wound responsive element

不同字母表示不同组织间的差异显著(P<0.05)图6 CsLEA5基因在不同组织的表达情况 Different letters represent significant differences among different tissues (P<0.05)Fig.6 Relative expression level of CsLEA5 gene in different tissues

不同字母表示同一处理不同时间的差异显著(P<0.05)图7 CsLEA5基因在低温和干旱胁迫下的表达分析 Different letters represent significant differences among different time points within same treatment (P<0.05)Fig.7 Expression analysis of CsLEA5 gene under cold and drought stress

3 讨 论

LEA蛋白作为一类重要的抗逆蛋白在植物抵御非生物胁迫过程中发挥重要作用，其功能机制受到越来越多的关注[26-30]。目前，从各种植物中克隆获得了大量LEA蛋白编码基因，但在茶树上关于LEA基因的报到非常有限。本研究在前期工作的基础上克隆获得了茶树的CsLEA5基因，其编码氨基酸序列含有一个典型的LEA_3保守结构域，属于LEA蛋白中LEA_3亚家族成员。系统进化树显示CsLEA5与醉蝶花、拟南芥、亚麻荠和藜麦中的

LEA5亲缘关系较近，但彼此间一致性较低，这符合LEA蛋白间具有较低一致性的特点[31]。

众多研究表明，植物LEA基因的表达具有组织特异性，如玉米ZmLEA5C在种子中特异性表达[10]，西瓜ClLEA3-1在根中的表达量远高于其他组织[14]，而花生LEA2则在叶片中特异性表达[27]。本研究中，茶树CsLEA5基因在不同组织中的表达量亦存在明显差异，在叶片中表达量最高，其次是嫩茎，而在根和花中的表达量较低，推测其在茶树新稍生长发育中具有重要作用。另一方面，越来越多的证据表明植物LEA基因的表达受各种环境胁迫所诱导，从而参与植物对逆境胁迫的应答过程，其中贾会丽等的研究表明紫花苜蓿MsLEA4-4基因的表达受干旱、高盐、ABA及多种重金属胁迫的诱导[32]；张业猛等[33]研究显示蒺藜苜蓿MtLEA5B基因受低温、干旱、高盐和ABA胁迫的诱导；滑璐玢等[34]研究表明柠条锦鸡儿CkLEA4-1基因的表达受干旱和高盐胁迫的诱导。本研究的qRT-PCR结果显示，CsLEA5基因在低温、干旱胁迫下被显著诱导表达，这与西瓜ClLEA3-1、玉米ZmLEA3在低温、干旱胁迫下的表达水平变化一致[11,14]，表明CsLEA5在茶树抵御低温、干旱胁迫过程中发挥重要作用。众所周知，启动子对调控基因的表达是至关重要的。本研究发现，CsLEA5基因启动子序列中包含多种逆境响应相关的顺式作用元件，如乙烯响应元件(ERE)、胁迫响应元件(STRE)及MYB和MYC转录因子识别位点等，表明CsLEA5基因的表达可能受相关转录因子的调控。同时，大量研究证实MYB转录因子以及ERF/DREB乙烯响应相关转录因子在植物低温和干旱胁迫响应过程中对下游功能蛋白基因的表达具有广泛调控作用[35]，因此推测低温、干旱胁迫对茶树中CsLEA5基因的诱导表达可能依赖于上游MYB、ERF/DREB等转录因子的调控。

目前，关于逆境胁迫下LEA蛋白的作用机制主要有脱水保护剂的作用、对其他蛋白质或膜结构的保护作用、渗透调节作用和离子鳌合剂的作用[36]，而LEA蛋白的高亲水性和稳定性是上述功能的结构基础[37-38]。本研究中对CsLEA5蛋白理化性质预测显示其具有较高亲水性和稳定性，这可能对提高茶树低温、干旱胁迫抗性有重要意义，其具体的作用机制还有待进一步研究。