抗氧化剂对家畜精液冷冻保存效果的影响研究进展

张利坤，井辛宇，白 腾,李 宇，任 发，温 飞，康怀艳，李 梅，胡建宏，*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.白水县畜牧技术推广站;3.子州县畜牧技术推广站； 4.白水县家畜改良站)

近年来，随着我国畜牧业的发展，家畜养殖数量在不断的增加，养殖规模在不断的扩大，人工授精技术也在家畜生产上得到了广泛应用。人工授精技术在养殖业中的应用，不仅有效降低了病原菌在家畜交配过程中的传播，而且提高了良种公畜的利用率，从而大大减少养殖资金投入，增加养殖收入。家畜人工授精技术的应用离不开精液的体外保存，高质量的体外保存精液是提高种公畜利用率和母畜受胎率的必然保障。精液冷冻保存便于精液长期体外储存和长途运输，遗传资源可以跨时间和跨地域得到应用，从而扩大了优良畜种遗传资源的应用与推广，加快了优良畜种的改良进度。虽然精液冷冻保存具有很大的应用前景，但是在精液冷冻保存的过程中，精子细胞内外环境会发生极大的变化，精子细胞会受到不同因素的损伤，包括冷休克、冰晶损伤、氧化应激等，造成解冻后精液品质下降，严重影响并制约精液冷冻保存技术的发展。在精液冷冻的过程中，精子细胞会产生过量的活性氧，对精子结构和功能的完整性造成氧化应激损伤。大量研究表明，在精液冷冻保存中，外源抗氧化剂能有效减少精子细胞所产生的过量活性氧，降低精子的氧化损伤程度，提高冻融后精液品质。目前，精子的冷冻损伤机制和抗氧化剂的筛选，仍需要进一步探究。因此，本文主要对常用抗氧化剂的特性及其保护精子免受氧化性损伤机理进行综述，以期为家畜精液的冷冻保存提供一定的理论依据，为进一步发挥良种优势提供科学资料与参考。

1 精子冷冻保存氧化性损伤机制

在精液冷冻保存的过程中，精子细胞内外环境发生极大的变化，精子细胞会产生过量的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，ROS 携带着氧化性极强的自由基，极易与精子质膜发生脂质过氧化反应或对精子细胞内组织造成损伤，使精子失去正常的生理功能。在正常生理条件下，精子细胞自身含有抗氧化体系，精子细胞内含有一定浓度的ROS，低浓度的 ROS可以维持细胞结构和功能的完整性。在冷冻条件下，精子内用于消除ROS的抗氧化酶活性会大大降低，ROS的产生速率超过机体内抗氧化体系清除ROS的速率，使得精子细胞内ROS含量过高，造成精子氧化损伤，最终导致精子活率和活力降低。

2 抗氧化剂对冷冻精子的作用

抗氧化剂是一类能够有效抑制氧化反应的物质，易与活性氧携带的氧自由基结合，阻止 ROS和精子细胞质膜中的不饱和脂肪酸形成共价链接反应，保护精子免受氧化应激损伤，进而提高精子的冷冻保存质量。因此，外源抗氧化剂添加到精液冷冻稀释液中，能够降低精子冷冻过程中所产生的过量活性氧，降低ROS对精子的氧化应激损伤程度，提高冷冻精液品质。抗氧化剂的种类很多，常见的抗氧化剂可分为酶类抗氧化剂和非酶类抗氧化剂。

2.1 酶类抗氧化剂

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)。SOD和CAT是精浆和线粒体内存在的最基本的抗氧化剂，SOD能将O2-转变为弱毒性 H2O2，CAT能够迅速将H2O2降解为H2O，从而起到保护精子免受氧化应激损伤的作用。

刘超等研究结果表明，山羊精浆中添加SOD能有效提高精子的活力。Li研究表明，在精液冷冻稀释液中，添加 CAT 能够有效提高冻融后精液品质。王贞研究发现，单独添加SOD或CAT都能改善冻融后猪精液品质，但是SOD和CAT组合添加效果更好。

2.2 非酶类抗氧化剂

2.2.1 维生素类抗氧化剂

维生素C(Vitamin C，VC)又称抗坏血酸，属于水溶性维生素，具有清除ROS而发挥其抗氧化作用，有效提高冻融后精液质量。权富生等研究表明，在无角道塞特绵羊冷冻精液稀释液中，添加浓度为4.4 mg/mL VC有效提高了精液品质。黄俻华研究发现，600 μg/mL VC可以显著提高陆川猪解冻后精子活力(P< 0.05)，畸形率显著降低(P< 0.05)。HU研究结果表明，4.5 mg/mL VC能显著改善冻融后精液品质，并且能提高精浆中抗氧化酶的活性，有效保护精子质量。

维生素E(Vitamin E，VE)又称α-生育酚，属于多酚类脂溶性维生素，是一种非常有效的预防诱发脂质过氧化反应的抗氧化剂。VE易与细胞膜上的磷脂结构相结合，阻止ROS和膜脂质中的脂肪酸发生共价链接反应，有效减轻精子细胞受到的氧化应激损伤程度，保护精子的正常性能。赵宪林等研究发现，在冷冻精液稀释液中，浓度为0.4～0.8 mg/mL的 VE可以提高秦川牛精液中抗氧化酶的活性，对精液品质具有保护作用。康孟阳研究表明，关中驴冷冻精液稀释液中添加 600 mg/LVE有效提高了解冻后精子完整率和活率。吴大平研究发现，水牛冷冻稀释液中添加0.4 mg/mL的VE能够较好的保护冻融后精子质膜的完整性，同时显著提高了GSH-Px酶的活性(P< 0.05)，显著降低了精子畸形率(P< 0.05)。大量研究表明，VE与其他抗氧化剂组合添加到精液冷冻液稀释液中，具有更强的抗氧化效应。Zhao等研究发现，在秦川牛精液冷冻稀释液中，添加0.12 IU/mL VE与和400 IU/mL Vc能有效提高精液中CAT及GSH-Px的活性，起到保护精液品质的作用。

由此说明，在家畜精液冷冻保存过程中，维生素能有效提高冻融后精液品质。目前，VC和VE是较为常用的抗氧化剂。VC和VE与其他抗氧化剂的组合效果及其最佳配伍浓度，仍需要进一步探求。

2.2.2 氨基酸类抗氧化剂

(1)半胱氨酸

半胱氨酸是一种天然氨基酸，属于含硫非必需氨基酸。半胱氨酸极易被氧化还原成胱氨酸，它具有一定的抗氧化性。因此，半胱氨酸在精液冷冻保存过程中，可以保护精子质膜免受氧化损伤。有关研究表明，在牛精液冷冻过程中，2 mmol/L半胱氨酸可以有效保护线粒体和顶体的完整性。范楚宁研究发现，5 mmol/L或7.5 mmol/L的半胱氨酸对獭兔的精液保存效果最佳。Khalili研究表明，15 mmol/L 的半胱氨酸能显著提高羊冷冻精液的质量(P< 0.05)。

从以上结论可以看出，不同种类动物的冷冻保存精液稀释液中所添加的半胱氨酸浓度差异较大，其原因需要进一步的探究。

(2)麦角硫因

麦角硫因是自然界存在较少的天然氨基酸，动物体内麦角硫因是一种很重要的低分子量硫醇，能够清除单线态氧、羟基和过氧自由基，具有很强的抗氧化性。麦角硫因可以激活抗氧化酶的活性，如谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性。机体组织代谢中含有微量的麦角硫因，可以螯合二价金属离子，麦角硫因与铁、铜、锌的代谢密切相关。

Coyan等研究发现，在美利奴公羊冷冻精液补充液中，麦角硫因可以保护精子细胞免受氧化应激损伤。麦角硫因具有天然无毒的性能和较强的抗氧化性，其将成为取代其他抗氧化剂的最适选择。

2.2.3 多糖类抗氧化剂

海带多糖为海带提取物，具有良好的药理功效，调节免疫系统、调节细胞因子、降血压、抗氧化等。红景天是一种多年生草本植物。红景天多糖是红景天植物的提取物，能够清除活性氧自由，具有良好的抗氧化性能。另外，多糖具有一定的粘性，可以粘附在精子周围，提高精子细胞周围的渗透压，使得胞内失水，减少细胞内冰晶形成，起到保护精子的作用。张婷研究发现，精液稀释液中添加浓度为0.5～1.5 mg/mL的海带多糖对猪精子的结构和功能有显著保护作用，有效提高了冻融后精液品质。康孟阳在关中驴冷冻精液稀释液中，1 500 mg/L海带多糖能有效保护精子的结构和功能的完整性。HU等结果表明，海带多糖能提高精子活率，同时能增强精浆中抗氧化酶的活性。陈西英研究结果表明，精液稀释液中，海带多糖浓度为1.0 mg/mL对保护精子的效果最好。曹华琳将浓度为0.06 mg/mL红景天添加到牛精液冷冻稀释液中，能提高解冻后精液中抗氧化酶的活性，降低氧化应激损伤程度，保护精子质膜的完整性。

多糖是由单糖通过糖苷键连接而成的化合物，属于非渗透性保护剂。多糖具有抗氧化性，它不仅能降低活性氧的量，而且能提高过氧化酶的活性，最终降低细胞的氧化损伤程度。另外，在精液冷冻的过程中，多糖在精子外围聚集，提高外围渗透压，引起细胞失水，减少冰晶损伤，达到保护精子的作用。目前，从众多研究中发现，多糖类抗氧化剂对冷冻精子的保护作用，其组合效果要优于单独添加的效果。这需要进一步探讨合适配伍的抗氧化剂及其添加的浓度，期望优化冷冻稀释液的配置，提高家畜精液冷冻保存效果。

2.2.4 其他抗氧化剂

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是细胞内含有巯基的非蛋白化合物，属于一种多肽，它通过巯基发挥抗氧化作用，同时具有维护外源性抗氧化剂的作用。GSH具有抗氧化和抵御细胞毒性的功能，GSH 可以通过多种方式保护家畜精子的氧化应激损伤，一方面GSH与氧自由基结合而直接清除自由基；另一方面GSH可催化GSH-Px 活性，使精子细胞内低毒性的H2O2转化为H2O。另外GSH 能于磷脂结构的细胞膜形成稳定的化合物，保护细胞免受氧化应激损伤。

据报道，在公羊精液稀释液中，添加2 mL的GSH能够增强谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，减少了自由基形成和提高了精子活率。康孟阳研究发现，在关中驴冷冻精液中，1 000 mg/L的GSH可以提高解冻后精子结构完整性和精子活率。段洪云等研究表明，GSH可以与细胞膜的脂肪酸形成稳定的化合物，使精子细胞免受ROS的氧化损伤。Muhammad等研究结果说明，GSH能保护绵羊精液冻融后DNA的完整性及提高精液品质。

由此可见，GSH具有较强的抗氧化性，对提高冷冻精液品质有一定的作用，可以通过试验研究推广GSH的使用范围。

褪黑素(Melatonin，MLT)是一种胺类激素，具有非常强的清除活性氧自由基的功能，通过抑制氧化反应来保护细胞膜脂质结构、核酸、蛋白质等。褪黑素不仅能够清除活性氧自由基，而且可以清除自由基的产物，还能促进抗氧化酶的表达，以及降低促氧化酶的活性。杨宝卫等研究结果表明，10 mmol/L的褪黑素能有效降低冻融猪精子的死精子率，有效提高猪冻精品质。Amidi等研究发现，褪黑素可以提高多种动物冷冻精液的质量，包括山羊、公猪和牛等。吴大平研究表明，在水牛精液冷冻稀释液中，添加褪黑素可以降低精子的畸形率，提高冻融后精子活率和抗氧化物酶的活性，其最适添加浓度为0.2 mg/mL。李博玲等研究发现，添加0.25 mg/mL的褪黑素可有效提高冻融猪精液品质。

3 展望

目前，我国虽然家畜人工授精技术的应用与推广已取得显著成效，但是家畜精液冷冻保存技术仍有很大的发展空间。随着家畜精液冷冻保存技术的深入研究，抗氧化剂改善精液品质方面还需要进一步探究，如筛选天然植物提取抗氧化剂及不同抗氧化剂组合的实践应用效果，充分发挥抗氧剂对冷冻精子的保护作用，有助于加速精液冷冻保存技术的发展，提高优良畜种的利用率，进一步推动我国养殖业的不断发展。