组织工程支架材料对固有免疫反应的影响及调控效应

陈坤威，童亚林，姚咏明

固有免疫通常被认为是微生物感染的第一道防线，在过去的十几年中，越来越多的证据显示固有免疫细胞在机体内环境稳态、组织修复与再生中具有重要作用[1-3]。当组织损伤后，多种免疫细胞参与组织修复，其中固有免疫细胞起到至关重要的作用，了解固有免疫细胞在组织修复过程中的确切作用，特别是组织工程材料植入后的变化，能为未来设计出具有良好免疫调控性能的支架材料提供有益线索。组织工程支架材料的设计目标是能为创伤、疾病或先天畸形的患者提供一种组织缺损的替代物[4]。以往参与组织修复的支架材料通常需整合细胞及生物学信号，近年来的研究显示单独的支架材料成分也能起到促进组织修复与再生的作用。多项观察证实，支架材料特性诸如材料成分、材料表面化学特性、理化特性(硬度、厚度、孔隙大小、化学基团修饰等)及材料的降解产物均可影响材料的免疫原性，对多种固有免疫细胞产生作用，出现宿主反应强度的差异性变化。本文拟对常见固有免疫细胞在组织损伤修复中的作用、组织工程支架材料特性对固有免疫系统的影响及潜在应用作一综述。

1 固有免疫细胞与损伤修复

典型的组织损伤要经历炎症期、增生期、重塑期/瘢痕形成期三个阶段。免疫反应参与了组织损伤后修复与再生过程，持续时间数天至数周不等。固有免疫细胞是最早参与损伤后免疫反应的免疫细胞，通过抵御潜在病原体入侵损伤组织，第一时间起到防御作用。即使在没有病原体入侵的情况下，免疫细胞也会被损伤组织中释放的危险信号激活，产生无菌性炎症。常见的固有免疫细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells，DC)。

中性粒细胞是免疫系统中数量最多的细胞，在组织损伤修复中表现出促进与抑制修复的双重作用。一方面，中性粒细胞自身具有抗菌效应(产生抗菌肽、活性氧、蛋白酶)，同时可通过激活其他免疫细胞减少损伤组织的感染概率；另一方面，中性粒细胞分泌的蛋白酶(如丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶)及中性粒细胞来源的各种介质会加重组织损伤，延长修复过程[5]。中性粒细胞分泌的细胞因子与生长因子，如IL-17及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor α，VEGF-α)，能招募和活化更多的中性粒细胞及其他炎性细胞，促进血管生成，刺激成纤维细胞、表皮细胞及角化细胞的增殖[5]。中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)可以捕获杀灭病原菌，提高中性粒细胞吞噬效应；但在组织损伤修复过程中，有证据表明中性粒细胞胞外诱捕网可能加重组织损伤，延长修复时间[6]。单核细胞及巨噬细胞能吞噬死亡的中性粒细胞及细胞碎片，中性粒细胞也可通过增加对单核细胞与巨噬细胞的招募表现出一部分抗炎能力，达到实现自我清除的目的，有助于炎症的消散[7]。由于中性粒细胞在组织修复中的双重作用，调控中性粒细胞的数量及功能可能成为促进组织修复与再生新的切入点。

巨噬细胞在免疫系统中一直扮演清道夫细胞的角色，吞噬细胞碎片、入侵的病原体及其他凋亡的细胞。除了传统认识上的吞噬作用，越来越多的证据显示，巨噬细胞还具有调节组织修复的效应[8]。组织损伤后，巨噬细胞是炎症反应中多种趋化因子、基质金属酶及炎症介质的主要来源[9]。在损伤初期，减少巨噬细胞数量可以使炎症反应明显减轻，然而，缺少巨噬细胞同时也导致组织愈合及再生效率下降[10]。巨噬细胞主要存在两种极化状态，分别为促炎M1型巨噬细胞与抗炎M2型巨噬细胞，多项研究证明巨噬细胞的不同活化状态在组织修复、再生、纤维化中具有重要意义。目前普遍认为促炎型M1型巨噬细胞虽然能清除损伤部位的微生物及碎片，但在组织修复过程中会加重组织损伤，影响组织修复结局；而M2型巨噬细胞表现为促进组织修复与再生[11]。组织损伤炎症反应高峰期过后，M2型巨噬细胞数量上逐渐处于优势，产生大量促进细胞增殖及血管生成的生长因子，包括血小板来源的生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子(transforming growth factor β1，TGF-β1)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)及VEGF-α，产生溶解性介质促进组织成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，同时合成细胞外基质成分，加快损伤部位收缩闭合[8]。在体外实验中，M1型巨噬细胞能被干扰素-γ(IFN-γ)或TNF-α诱导产生，而M2型巨噬细胞则被IL-4或IL-13诱导产生，且根据刺激因素的不同，巨噬细胞的功能也会出现差异。IL-4活化产生的M2型巨噬细胞表达多种损伤修复因子，然而若持续受到IL-4刺激，巨噬细胞则促进病理性纤维化的形成[1]。IL-6及IL-21能上调巨噬细胞IL-4受体的表达，当巨噬细胞受到IL-4或IL-13刺激后，IL-6及IL-21能促进具有抗炎及抗纤维化功能的巨噬细胞产生[1,8]。鉴于巨噬细胞在组织修复各阶段所起到的作用，深入了解巨噬细胞在不同微环境下的功能变化，进一步对巨噬细胞功能进行调控，对提高组织修复能力具有重要意义。

DC是机体内重要的抗原提呈细胞，与巨噬细胞类似，DC也具有在损伤部位吞噬微粒及处理危险信号的能力。虽然目前对DC在组织修复与再生中的确切作用尚未充分阐明，但已有资料提示DC在组织修复过程中具有不可替代的作用[9-11]。例如，浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)能通过Toll样受体(TLR)7与TLR9识别皮肤损伤处的核酸，并产生Ⅰ型干扰素参与伤口愈合修复[12]。Vinish等[13]发现，DC缺乏的小鼠烧伤创面出现明显的闭合延迟。此外，在小鼠心梗模型中，DC缺乏的小鼠相对于正常小鼠心梗后左心功能障碍及心室重构明显加重，进一步观察发现在缺血梗死部位促炎M1型巨噬细胞浸润增加，抗炎型M2型巨噬细胞数量明显减少[14]。因此，DC可能通过调节巨噬细胞的动态平衡发挥调控损伤修复的作用。

2 生物材料支架与异物反应

组织工程生物材料支架作为损伤组织的替代物在临床上已被广泛应用，支架材料的成分广义分为天然材料与合成材料。临床上使用的组织工程支架材料通常需要整合信号或细胞以提高材料的组织修复性能，如各类化学信号、生长因子、间充质干细胞等。目前，关于材料本身免疫原性的调控参与组织修复过程研究逐渐成为热点，通过改变材料特性以提高材料的组织相容性，减少或避免材料引起的异物反应、纤维包裹及其他有害的降解产物对组织修复的影响。

当生物材料支架植入机体与血液接触后，材料表面即附着上一层蛋白质，促进富含生长因子、细胞因子及趋化因子的血凝块(临时基质)的形成，临时基质招募固有免疫细胞到损伤部位形成肉芽肿；肉芽肿逐渐形成瘢痕组织并最终完成损伤修复，在此过程中还有异物巨细胞的出现，这些继发性的变化是材料植入体内引起异物反应的全过程[11]。异物反应常难以避免，过度的异物反应可以延长组织愈合的时间，增加瘢痕组织的形成，对创面的损伤愈合起到负向调节作用。材料植入体内所导致急慢性炎症的严重程度由植入材料的类型、临时基质形成程度及炎症消散所需时间决定[11]。因此，有关支架材料的研究希望通过改变上述因素起到调节机体炎症免疫强度，达到促进组织修复、降低异物反应程度及瘢痕组织形成的目的。

3 组织工程支架材料特性对固有免疫反应的影响

3.1 支架主要成分 Park等[15-16]研究发现，多种生物材料薄膜(藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸及聚乳酸)能引起DC不同程度地活化，分泌不同水平的细胞因子。例如，聚乳酸、壳聚糖、藻酸盐引起DC促炎细胞因子的释放；聚乳酸、壳聚糖诱导CD80、CD86、CD83及CD44表达增高；透明质酸则引起较低水平CD40、CD80、CD86及人类白细胞抗原(HLA)-DR表达及较低水平促炎因子的产生，并进一步刺激T细胞表面分子CD4、CD8、CD25、CD9表达及不同细胞因子改变(IFN-γ、IL-10、IL-4)，且DC与琼脂糖共培养后诱导CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞的产生。

在另一项关于支架成分免疫原性研究中，来源于机体不同组织的细胞外基质支架材料，包括小肠黏膜下层、膀胱、骨骼肌、脑、食道、皮肤、肝脏和结肠，可引起巨噬细胞向不同的表型极化。小肠黏膜下层、脑组织、食道及结肠来源的细胞外基质材料诱导巨噬细胞向M2型极化，皮肤来源的支架材料诱导巨噬细胞往M1型方向极化。实验结果提示，不同组织来源支架材料成分的免疫原性存在明显差异[17]。

3.2 表面化学特性

3.2.1 表面形貌学 Chang等[18]研究显示，中性粒细胞黏附在较粗糙的聚苯乙烯表面后死亡速度明显加快，可能与其黏附在粗糙材料表面产生更多的氧自由基有关。另一项实验中，与表面光滑的钛材料相比，表面轻度粗糙的钛材料使巨噬细胞分泌促炎细胞因子增多，如TNF-α、IL-1β等，表明表面较粗糙的材料更容易引起炎症反应[19]。本文第一部分提及，炎症可能是延缓损伤愈合的关键性因素之一，因此选择表面较光滑的材料可能具有较好的组织相容性，引起更少的炎症反应，对组织的修复更有利。

3.2.2 表面电势 虽然目前有文献论述了生物材料表面电势对免疫细胞的影响，但材料表面电荷的确切作用仍然没有明确[20]。据报道，纳米杆氨基末端带表面正电荷，诱导巨噬细胞向抗炎M2型方向极化；而纳米杆的羧基末端带表面负电荷，诱导巨噬细胞向促炎的M1型极化[21]。Neumann等[22]观察到带正电荷的壳聚糖纳米微粒能激活炎性体，促进IL-1β的分泌，具有促炎效应。采用羟基聚乳酸乙醇酸(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)、聚苯乙烯或微钻石所合成的微粒，都带表面负电荷，能够抑制巨噬细胞向促炎型M1型巨噬细胞极化[23]。

3.2.3 表面亲水性与疏水性 Alfarsi等[19]发现表面经过亲水改性后的钛金属材料引起巨噬细胞分泌更少的TNF-α、IL-1α、IL-1β等炎性细胞因子。另据报道，在电中性亲水性聚合物材料上观察到较少的巨噬细胞黏附，以及较少的异物巨细胞形成，但比较电中性亲水材料上的巨噬细胞和其他两种非电中性疏水材料上的巨噬细胞，证实细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8及IL-10)的产生明显增多[24]。由此可见，亲水性材料引起炎症反应可能比疏水性材料要轻微，在生物材料的选择上，增加亲水性材料的比例可能更有利于炎症的控制及组织损伤修复。

3.2.4 表面涂层 通过材料表面涂层修饰可有效降低蛋白质的吸附及白细胞黏附，CD47是一种广泛存在的跨膜蛋白，通常作为一个“自我识别”的标记物。有研究发现，预先用CD47涂在高分子聚氯乙烯(PVC)上可明显降低中性粒细胞的聚集与黏附[25]，提示选择组织相容性较好或免疫反应较低的表面涂层材料，可通过减少材料表面的中性粒细胞的数量，降低材料与组织的免疫炎症反应，进而有益于损伤修复。

3.3 理化特性

3.3.1 孔径大小及孔隙率 近年来，许多资料提示表面材料的孔隙影响机体固有免疫反应。Sussman等[26]观察到异物反应强度在有孔材料与无孔材料间存在明显差异，有孔材料引起较少的纤维包围及更高的血管生成率。进一步分析证实，材料孔隙影响巨噬细胞极化，在孔隙内巨噬细胞极化方向明显偏向M1型，M2型巨噬细胞数量相对减少；而在孔隙外，M2型巨噬细胞比例明显增加，且当孔隙大小在34μm时，孔隙内M1型巨噬细胞比例最高。虽然有孔材料能通过改变巨噬细胞功能促进组织修复，但孔隙对材料的机械强度同时也存在负面影响[27]。Kim等[27]将等量的致孔剂分别与不同质量的聚乙丙交酯(PLG)制成不同孔隙率的三种材料，在体外细胞种植实验中，发现孔隙率大的材料能获得更多的DC细胞。然而体内实验结果则恰恰相反，三种材料中较低孔隙率材料招募的DC数量最多，原因是高孔隙率材料在植入体内后由于机械强度降低出现明显的压缩现象，导致孔隙压缩变小，因此在设计带孔隙支架材料时，需考虑其机械强度的变化。由于不同特质的材料最佳的孔径大小可能存在较大差异，不同材料可能还需要进一步检测其最佳孔径大小，且在保证具有足够机械强度的前提下，尽可能增加材料的孔隙率可能使材料对巨噬细胞的影响朝着M2型方向极化更有利，也更有利于创面愈合。

3.3.2 硬度 Blakney等[28]将巨噬细胞培养在抗压系数(硬度)分别为130、240、840kPa的聚乙二醇水凝胶上，发现不同抗压系数的水凝胶不会影响巨噬细胞在材料上的附着，但会引起细胞形态改变，巨噬细胞形态在130kPa的水凝胶上呈圆形，但在更高抗压系数的水凝胶上，巨噬细胞形态会被拉伸，并且巨噬细胞培养在抗压系数较低的水凝胶上，产生的TNF-α、IL-1β、IL-6水平较培养在抗压系数较高的水凝胶上低。同样，将材料植入小鼠皮下后发现，抗压系数最低的水凝胶引起的异物反应最弱。严重的异物反应不利于组织损伤修复，选择抗压系数低的材料在组织修复愈合方面的应用可能较系数高的材料更有优势。

3.3.3 厚度 Wang等[29]从基因水平探讨了材料厚度对巨噬细胞功能的影响，结果显示巨噬细胞移动抑制因子-1(macrophage migration inhibitory factor-1，MIF-1)基因表达与M1型巨噬细胞极化密切相关，选择活化型巨噬细胞的特异性标志物精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)和发现于炎症区域-1(found in inflammatory zone-1，Fizz-1)基因与M2型巨噬细胞极化关系密切。研究还显示，较厚的(大约5μm)电纺丝聚已内酯(PCL)材料能诱导巨噬细胞向M2型极化，抗炎细胞因子Arg-1及Fizz-1基因表达明显上调；较薄的(大约0.5μm)PCL材料则更倾向诱导巨噬细胞往M1型方向极化，IL-6、TNF-α、MIF-1基因表达明显增加。故在同一种材料的选择上，较薄的材料可能比较厚的材料促炎效应更明显，更不利于创面闭合。此外，较厚的支架材料还具有更好的促进血管再生作用。

3.3.4 空间结构 3D组织工程支架材料在组织工程学中是一个新兴的研究领域，随着3D材料应用于创伤修复与再生医学研究的陆续开展，关于组织工程支架材料的3D结构对固有免疫细胞影响的报道逐渐增多。Daneshmandi等[30]在研究胶原/壳聚糖纳米支架3D结构对DC成熟的影响中证明，对比2D环境下培养，在3D支架结构培养下DC表面分子CD40、CD86、MHC Ⅱ表达和细胞因子IL-12、IL-6、TNF-α分泌明显增加，与T淋巴细胞共培养时IFN-γ、IL-4释放水平也比2D环境下增多。Friedemann等[31]在胶原(Coll)、透明质酸(HA)、高度硫酸化透明质酸(sHA)空间结构的对比实验中发现，2D胶原材料促使巨噬细胞分泌更多IL-10、IL-12和TNF-α，2D条件下透明质酸及高度硫酸化透明质酸IL-12及TNF-α分泌量较低，但IL-10分泌量比3D条件下增多。同样，3D壳聚糖支架的几何结构能够影响单核细胞TNF-α及IL-12、IL-23的产生，设计时在结构上用更大孔径及更大角度的壳聚糖3D支架材料诱导产生更多TNF-α[32]。

3.3.5 化学基团修饰 化学基团修饰是组织工程学材料改性常用的一种技术手段，但增加或减少某些化学基团可能会对材料的免疫原性产生影响。壳聚糖是甲壳素脱N-乙酰基的产物，有学者发现不同乙酰化程度能影响巨噬细胞极化，乙酰化程度为15%的3D多孔壳聚糖支架材料有较多炎性细胞浸润，引发巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α明显增加，诱导巨噬细胞向M1型极化；与之相反，乙酰化程度为5%的壳聚糖材料中炎性细胞黏附数量相对较少，能检测到较高水平IL-4的分泌，巨噬细胞呈现M2型特性[33]。Franz等[34]采用胶原与高度硫酸化透明质酸组成的复合涂层材料(Coll/hsHA)培养巨噬细胞，对比其轻度硫酸化的复合涂层材料(Coll/lsHA)及未硫酸化的复合涂层材料(Coll/HA)，发现高度硫酸化涂层材料能明显减少巨噬细胞分泌促炎细胞因子(TNF-α、IL-12)，并增加巨噬细胞抗炎细胞因子IL-10的产生，且分泌细胞因子水平与透明质酸硫酸化程度相关。生物材料中基团的添加在以往的材料设计中主要是考虑改变材料某方面的机械特性，但通过改变材料的化学基团进而影响免疫细胞功能的方法，可以为未来的材料设计提供一种全新的设计思路。

3.3.6 交联 交联是增加组织工程学材料机械特性常用的方法，据报道，藻酸盐用钙离子交联形成的藻酸钙水凝胶能明显增强DC活化，同时也明显增加IL-1β的分泌。同样情况下，改用钡离子交联，并未出现IL-1β分泌增多。藻酸盐水凝胶是组织工程中常用的材料，且经常用钙离子交联增加其机械强度，这项研究提示钙离子交联后可能影响材料的免疫原性，因此材料设计需单独考虑钙离子的促炎效应[35]。

3.4 降解产物 许多药物传递系统与组织工程学方法都使用可降解的生物材料作为载体或支架，随着材料在体内降解的同时可能伴有材料理化性能改变，目前需要迫切地了解随着生物材料的降解、特性改变及副产品的形成，生物材料免疫原性是如何发生变化的。早期关于生物材料降解的影响主要集中在透明质酸的研究上。在相关实验中，透明质酸被酶解形成各种分子量大小的片段，观察对DC免疫功能的影响，结果显示低分子量的透明质酸(1500-5300D)通过触发TLR2及TLR4信号通路，能增强DC活化、促进TNF-α分泌及T淋巴细胞增殖活性[36]。在巨噬细胞实验中，发现低分子量透明质酸可诱导巨噬细胞向M1型极化，而高分子量透明质酸诱导巨噬细胞向促进组织修复与愈合的M2型巨噬细胞极化[37]。趋化因子CCL2可诱导趋化巨噬细胞在损伤部位聚集，是常见的巨噬细胞趋化因子，有证据表明，在一项关于壳聚糖降解产物促进神经修复的研究中，壳聚糖的降解产物壳寡糖(chitooligosaccharides，COS)具有通过改善巨噬细胞构建的微环境进而促进神经修复的作用；进一步分析发现，COS作用在施旺细胞miR-327/CCL2靶点上，通过下调其miR-327进而诱导CCL2的表达，从而调控巨噬细胞在损伤部位的聚集，实现损伤部位微环境的重构及促进神经的再生[38]。另有两项独立实验证实，不同大小纳米材料[39]及不同形状纳米材料[40]能导致免疫系统不同程度地活化，说明支架材料降解后形成的不同大小片段及形状各异的降解产物同样会对免疫系统造成影响。

综上所述，通过免疫调节改善损伤修复预后是一个非常复杂的病理生理过程，不同组织损伤修复形成的局部微环境都不尽相同。组织工程材料特性对免疫系统的影响使我们认识到一个全新的、有价值的免疫治疗领域。业已明确，材料的成分、理化性质等诸多特性均能改变材料本身的免疫原性，对材料免疫特性的分析，有助于指导未来组织工程设计出更优化的具有免疫调控性能的支架材料，更加高效安全地促进组织的愈合与再生。值得指出的是，材料的不同特性也存在复杂的交互作用，相关免疫调控效应研究非常有限，需要更加深入的探索和了解，以促进其更快更好地向临床转化应用。