同位素标记相对和绝对定量结合二维液相色谱-串联质谱技术 在结核病诊断中的应用

哈斯来提阿依·买买提 胡昕 齐曼古力·吾守尔

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的危害人类身心健康的呼吸道传染性疾病[1]。WHO[2]在《2017年全球结核病报告》中指出，全球新增结核病患者1040万例，死亡患者达170万例，结核病成为了全球第九大致死性疾病[3]。近几年，随着耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的暴发流行，结核病并发HIV感染者增多，使我国结核病疫情再度回升。据WHO[2]估算，2017年全球MDR-TB新发患者约49万例；我国作为全球27个MDR-TB高负担国家[4]，新发MDR-TB患者例数仅次于印度[2]。因此，早期发现、干预、治疗依旧是我国控制结核病工作的重点。

结核病诊断方法及血清蛋白质组学来源

一、常用结核病诊断方法

结核病常用诊断方法有实验室检查法，如痰涂片法；此方法虽操作简单、廉价，但阳性率仅为20%～30%[5]。相比之下，痰培养成了诊断结核病的金标准，提供了比痰涂片更高的阳性率(30%～40%)[5]；但培养耗时较长，不能用于结核病的早期、快速诊断。结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative, PPD)试验，在诊断结核病中漏诊率可达18.3%[6]；甚至在迟发型变态反应、免疫力低下、应用免疫抑制剂、百日咳、麻风等患者中可出现假阴性[7]。影像学检查法，如X线胸部摄影，对于微小病灶检出率低，胸部CT检查能弥补以上缺陷，被看作诊断结核病常用的检查手段而广泛使用。因结核病病灶在影像学上表现多样化，容易与肺炎、慢性阻塞性肺疾病等混淆。分子生物学检查，如荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorosence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)法[8]，其阴性预测值只有49.1%。因此，迫切需要找出既快速又准确的结核病诊断方法。

二、血清蛋白质组学来源

随着生物学技术的发展，研究者们将结核病诊断的重点开始转向能反映机体状态的蛋白质组学研究。1991年Nagai 等[9]首次应用双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术，对MTB H37Rv菌株2～10周培养滤液中的蛋白质进行分离鉴定，拉开了MTB蛋白质组学研究的序幕。其中，同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative absolute quantitation，iTRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱技术(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2DLC-MS/MS)，即iTRAQ-2DLC-MS/MS技术因分离能力强、分析范围广、敏感度高、特异度高、自动化程度高等诸多优点，受到研究人员关注并逐渐得到广泛使用。

血清蛋白质组学概述

血清蛋白质组学本质上是指在大规模水平上研究血清中蛋白质特征的一门学科。当机体受刺激或生理功能发生变化时，血清蛋白也随着出现相应变化。血清蛋白质组学作为一种整体、动态、定性、定量、全面分析蛋白质的功能、组成及相互关系的一门学科，发现与疾病相关的血清蛋白标志物有重大意义。Li等[10]运用iTRAQ技术[11]联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱[12](matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术来研究结核病患者和健康人群血清标本，发现性激素结合球蛋白(sex hormone binding globulin，SHBG)可作为结核病潜在诊断性血清学标志物。Wang等[13]运用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术研究发现，CD44、激肽原1重组蛋白(recombinant kininogen 1,KNG1)含量在MDR-TB患者血清中明显升高，可作为诊断MDR-TB潜在的血清蛋白标志物。其中，iTRAQ-2DLC-MS/MS技术因分离能力强、分析范围广、敏感度高、特异度高、检测限低、自动化程度高等诸多优点，受到研究人员的关注并使用。

iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白质组学技术原理

iTRAQ-2DLC-MS/MS技术是指将iTRAQ与2DLC-MS/MS技术相联用，用核素标签的方法对复杂组分的蛋白样本进行分析研究的新型技术。其基本原理是先根据TRAQ[14]技术原理将试剂与赖氨酸侧链或肽段的N端发生反应，完成对肽段的标记，然后再利用2DLC-MS/MS[15]技术将血清样品分子进行离子化，并根据质荷比差异来分离，最终得到蛋白质的相对分子质量。其中TRAQ技术可标记相对分子质量8000～280 000(8～280 kD)[16]的蛋白，甚至可灵敏地检测跨膜蛋白，被用于研究宫颈癌[17]、口腔鳞状细胞癌[18]、肝细胞癌[19]等多种疾病的生物标志物。2DLC-MS/MS[15]技术可对肽及蛋白质的氨基酸序列及相对分子质量进行准确的测量，并分析蛋白质翻译后的修饰过程。当同位素标记与质谱技术联用时，信号离子表现为不同质荷比的峰，根据峰值可得到蛋白质的定量信息[20]，不仅定量结果精确，且稳定性好[21]，非常适合对多样本进行平行分析，应用于HIV并发肺结核[22]、前列腺癌[23]等多种疾病血清蛋白标志物的研究。

iTRAQ-2DLC-MS/MS技术在结核病血清蛋白质组学中的研究和应用

疾病的发生和发展涉及蛋白质水平的变化。MTB感染可通过多种途径在血液循环中引起结核病相关蛋白的变化。因此，血清蛋白也可以反映结核病患者的病理状态。因这些特点，越来越多的学者开始寻找结核病相关血清蛋白标志物，以提高结核病的诊断准确率。

一、iTRAQ-2DLC-MS/MS技术在结核病诊断中的应用

目前，iTRAQ-2DLC-MS/MS技术因较高的敏感度及特异度被众多研究者们关注。江婷婷[16]研究选取了136例肺结核患者及66名健康人群血清标本，进行脱盐、浓缩、还原、消化等处理后，用iTRAQ同位素标记联合2DLC-MS/MS技术对样本进行分析，最终选取维生素K依赖蛋白Z(human vitamin K-dependent protein Z，PROZ)、淀粉样蛋白A(serum amyloid protein A，SAA)和C4b结合蛋白β链(human C4b-binding protein beta chain，C4BPB)等在肺结核与健康人群血清中表达差异的蛋白，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法对差异蛋白行后续验证，构建含有验证蛋白质的结核病决策树。得出该诊断模型的准确率为97.2%，敏感度为97.06%，特异度为95.45%。因此，认为SAA、PROZ和C4BPB可能是肺结核的新型潜在诊断性生物标志物。Xu等[24]将结核病患者及健康人血清进行iTRAQ-2DLC-MS/MS分析比较，获得载脂蛋白II(apolipoprotein II，APOCII)、人CD5分子样蛋白(human CD5 molecular protein，CD5L)、重组人视黄醇结合蛋白(recombinant human retinol binding protein，RBP4)等两组人群血清中表达差异的蛋白。以蛋白质构建最优分类树诊断模型，该模型筛检的敏感度、特异度分别为93.42%、92.86%，对于结核病的诊断有一定的参考价值。

二、iTRAQ-2DLC-MS/MS技术在结核病及其他肺部疾病鉴别中的应用

肺炎和慢性阻塞性肺疾病也可能出现与活动性肺结核相似的常见症状，如胸痛、咳痰、发热和盗汗等。当痰涂片阴性时，痰培养成为主要诊断方法，但其所需时间长(约需4～8周)。尽管近年来核酸扩增技术已被开发用于诊断结核病，但使用该技术时，在支气管癌患者和有结核病病史的个体中发现了假阳性结果[11]。为了解决这些缺陷，Xu等[25]运用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术分析、筛选和鉴定结核病、肺炎、肺癌患者及健康人血清标本，最终发现基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、钙粒蛋白(calcareous protein，S100A9)和胞外超氧化歧化酶重组蛋白(extracellular superoxide dismutase recombinant protein，SOD3)含量在结核病患者血清中明显升高。用三者建立诊断模型，可将结核病与肺炎、肺癌鉴别开来。该模型鉴别结核病与肺炎、结核病与肺癌患者的敏感度分别为90%、85%。特异度分别为87.05%、90.05%；江婷婷[16]报告，采用上述技术鉴定和分析初治活动性肺结核、肺炎、慢性阻塞性肺疾病患者血清标本，并将筛检出的SAA、PROZ、C4BPB表达差异的蛋白组成决策树，该模型鉴别诊断初治肺结核与肺炎的准确度为85.2%，敏感度为95.60%，特异度为71.40%；与慢性阻塞性肺疾病鉴别的准确度为69.30%，敏感度为100.00%，特异度为72.50%。最终认为，三者可能是结核病潜在的血清生物学标志物，同时利用上述标记物可以鉴别结核病及其他肺部疾病。

三、iTRAQ-2DLC-MS/MS技术在结核病发展过程中的应用

血清蛋白标志物可能参与结核病患者潜伏期、活动期、转归期过程。血清或血浆蛋白水平的微量变化可提示机体是否处于MTB潜伏感染状态。活动性结核病患者病灶处于开放状态，MTB繁殖活跃、毒力强。Xu等[24]应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术，分析活动性肺结核患者及健康人血清蛋白，最终获得载脂蛋白cⅡ、类 CD5 抗原、透明质酸结合蛋白2、视黄醇结合蛋白4、血清淀粉样蛋白 A4和血浆酶原结合蛋白等血清蛋白标志物；Wang等[26]对规律抗结核治疗后患者及健康对照组血清进行分析，最终发现蛋白、解离抑制因子β、补体C3、纤维黏胶蛋白2、脂蛋白a水平较健康人群显著升高，认为这5种蛋白可能是治疗后结核病患者的血清蛋白标志物。

结 论

结核病作为古老的传染性疾病，早期发现和诊断依然是有效控制结核病的首要任务。血清蛋白质组学以高敏感度和特异度开始受国内外学者关注。结核病血清蛋白质组学研究结果初步显示，运用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术鉴定、分析结核病相关血清蛋白标志物，对诊断结核病具有较高的敏感度和特异度。当然这些特异血清蛋白标志物在不同类型结核病患者血清中表达水平有无差异，需要进行更深层次的研究。不可忽视的是，检测血清中结核病有关差异蛋白虽然具有高的敏感度和特异度，但是距离临床应用还需要很长一段时间，需要科学工作者不断印证并探索新型技术。目前iTRAQ-2DLC-MS/MS技术及有关肺外结核及其他传染性疾病应用血清蛋白质组学的研究极少，这就需要科学工作者不断探索更多肺外结核的相关标志物，以确定肺结核与肺外结核蛋白标记物有无差异，明确两者之间有无关系。同样，作为呼吸道传染性疾病，血清蛋白标志物与其他传染性疾病之间有无关联性，也有待做进一步探索。