外泌体生物学特性及其miRNAs治疗心肌梗死的研究进展

彭子健 综述 陈建英 审校

(1.广东医科大学，广东湛江524023；2.广东医科大学附属医院心内科，广东湛江524001)

心肌梗死作为冠心病的典型代表严重危害人类健康。中国居民2002—2015年心肌梗死死亡率总体呈上升趋势，而在美国，每年超过36万人死于冠心病，其中12万人死于心肌梗死[1]。如何提高梗死区域心肌细胞存活率、促进血管新生、减轻心肌纤维化及炎症反应、改善梗死后心功能等是心肌梗死研究领域关注的重点。近年来，干细胞移植治疗心肌梗死初见成效[2]，但其分化为成熟心肌细胞的概率很低，且移植后3周内存活率低至1%，然而干细胞发挥的心脏保护作用却至少维持了6个月[3]，提示其保护效应并非依赖于分化作用[4]。随后的研究证实，干细胞主要通过旁分泌机制释放外泌体从而发挥相应的生物效应，此外，大量证据表明干细胞源性外泌体的心脏保护作用与其携带的miRNAs密切相关。现对外泌体生物学特性及干细胞源性外泌体miRNAs在心肌梗死治疗中的研究进展做一综述。

1 外泌体生物学特性

外泌体(exosomes)是细胞分泌的直径为30～150 nm，密度为1.11～1.19 g/mL的脂质双分子层膜囊泡，其内含有大量蛋白质、核酸、脂质等生物活性物质[5]。据外泌体数据库ExoCarta(http://www.exocarta.org/)统计，目前不同来源的外泌体内已检测出9 769种蛋白，2 838种miRNA及1 116种脂质。外泌体作为生物活性物质的运输载体，在介导细胞间信号传递过程中发挥着重要作用，此外，外泌体因其低免疫原性、易于获取改造等优势，已被广泛用于心血管疾病的诊治研究工作中[6]。

1.1 外泌体的形成、释放与摄取

不同细胞来源或细胞处于不同微环境中所分泌的、通过不同途径进入体内的外泌体，其组成成分、分布归巢及发挥的生物学效应均不尽相同[7]。外泌体的这一异质性缘于其复杂的分泌及作用机制。细胞膜以内出芽(inward budding)的方式形成早期核内体(early endosome)，随后早期核内体界膜(limiting manbrane)内陷，形成多个腔内囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)，此时包含ILVs的早期核内体称作多泡核内体(multivesicular endosomes,MVEs)[8]。大部分的MVEs将与溶酶体、自噬体相融合并最终被降解，而小部分的MVEs将在Rab蛋白家族等协助下运送至细胞膜并与之融合，最终将ILVs释放出胞外，而被释放至细胞外环境的ILVs即为外泌体[9]。随后靶细胞将会通过膜表面配体-受体结合、胞吞作用或胞膜融合等方式摄取外泌体[10]。大部分进入靶细胞内的外泌体将被溶酶体所降解以供细胞代谢所需，仅有小部分的外泌体得以释放出内容物，并以此介导细胞间信号交换[9]。目前关于多泡核内体及外泌体在胞内不同命运的调控机制尚未阐明，但已有研究发现，运输所需核内体分选复合物依赖及非依赖性途径在调控这一复杂生物过程中起着重要作用，其中研究较为透彻的相关蛋白包括：4次跨膜转运蛋白家族(tetraspanin,CD9、CD63、CD81)、ALG-2相互作用蛋白X、肿瘤易感基因101蛋白及热休克蛋白70等[11]。

1.2 外泌体的提取、鉴定及储存

当前广泛用于提取外泌体的方法有：超速离心、超滤、聚乙二醇沉淀、密度梯度离心、免疫亲和捕获等，因其提取效果各异，故推荐采用优势互补的复合型提取方法以避免脂蛋白、病毒等杂质污染[12]。目前认为，外泌体的鉴定需通过电子透射电镜，纳米粒子跟踪分析及蛋白免疫印记等实验的相互印证[13]，此外，新近研发的纳米级侧向位移微流控芯片[14]与超高灵敏流式细胞仪[15]均被报道可用于鉴定外泌体，其效果有待进一步验证。日常实践中，常将外泌体短期保存于4℃或长期储存于-80℃的环境里，而研究表明，外泌体在不同冻存条件下均会发生诸如内容物丢失、形态结构变异等生物特性的改变[16]，为此建议选用新鲜提取的外泌体进行研究以提高实验的准确性及可靠性。

2 干细胞源性外泌体miRNAs与心肌梗死

干细胞具备强大的体外扩增及旁分泌效应，是获取外泌体的种子细胞。研究表明，外泌体内成熟miRNAs占总RNA含量的41.7%，是介导细胞间信号交换的关键成分[17]。MiRNA即微小RNA(microRNA)，是一组高度保守的小分子单链非编码RNA，由18～24个核糖核苷酸组成，主要通过抑制靶基因转录后翻译从而调节机体重要生命活动。越来越多的证据表明miRNAs参与调控心肌细胞的存活、增殖及血管新生等一系列心血管重要生理过程[18]，为此对近年来干细胞源性外泌体miRNAs治疗心肌梗死的研究进展作一梳理，以供参阅。

2.1 骨髓间充质干细胞源性外泌体miRNAs

骨髓间充质干细胞(BMMSC)因其来源广泛，易于获取，是制备外泌体的理想母体细胞。Zhang等[19]通过miRNA基因芯片分析发现，大鼠BMMSC来源的外泌体可通过上调miR-147等17个miRNAs，下调miR-326-5p等5个miRNAs从而调控血管内皮生长因子(VEGF)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、Wnt等相关通路，促进大鼠c-kit+心肌干细胞增殖迁移及血管新生。Shao等[20]则通过miRNA基因测序发现，大鼠BMMSC来源的外泌体通过上调miR-29、miR-24等，下调miR-130、miR-34等，进而调控Ras、PI3K/Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白等通路，促进H2O2氧化应激损伤下大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)的存活，减少心肌梗死区域纤维化及炎症浸润。此外，Yu等[21]发现，过表达心肌转录因子的大鼠BMMSC，其分泌的外泌体富含miR-19a，可通过抑制下游靶基因PTEN及Bcl-2相互介导因子的表达从而激活Akt/ERK通路，提高大鼠心肌细胞存活率，改善心肌梗死后心脏收缩功能。Chen等[22]则发现过表达miR-133a的大鼠BMMSC，其分泌的外泌体富含miR-133a，可通过抑制下游靶基因Snail-1(锌指蛋白的一种)的表达从而促进缺氧损伤下BMMSC的存活，减少心肌纤维化。除大鼠来源的BMMSC外，人体来源的BMMSC亦备受关注。Ferguson等[23]通过miRNA基因芯片分析发现，人BMMSC来源的外泌体高表达miR-1246等23个miRNAs，其中miR-199a可通过作用于靶基因CABLES1进而抑制Bax、P53及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9(caspase 9)的表达，减少H2O2刺激下小鼠心肌细胞的凋亡，而miR-130a-3p则可通过抑制HOXA5的表达，增强人脐静脉内皮细胞的成管能力。另外，Mayourian等[24]发现人BMMSC来源的外泌体可通过miR-21-5p作用于PI3K通路从而调控钙表达，增强心肌细胞收缩力。

2.2 心脏祖细胞及心球样细胞源性外泌体miRNAs

心脏祖细胞(CPC)及心球样细胞(CDC)因其能够客观地反映出心脏梗死区域发生的变化而备受关注。Gray等[25]通过微阵列分析发现，大鼠CPC经缺氧预处理后所分泌的外泌体高表达11个miRNAs，其中miR-292等7个miRNAs的差异性表达在随后的荧光定量聚合酶链式反应实验中得到验证。进一步研究发现，CPC来源的外泌体可通过miR-17及miR-210等作用于纤维化相关基因从而降低结缔组织生长因子及波形蛋白的表达，改善心肌纤维化。Xiao等[26]发现，大鼠CPC经H2O2预处理后所分泌的外泌体富含miR-21，随后通过双萤光素酶报告基因证实miR-21可与程序性细胞死亡蛋白4结合从而抑制其表达，减少氧化应激损伤下H9c2心肌细胞的凋亡。与大鼠来源的干细胞相比，人体来源的干细胞更有望用于临床转化。Tseliou等[27]研究发现，人CDC来源的外泌体可通过传递miR-146a-5p等作用于人心肌纤维母细胞，抑制其分泌转化生长因子-β，促进其分泌基质细胞衍生因子及VEGF从而减轻大鼠心肌纤维化，改善心室重构及心功能。另外，Geoffrey等[28]通过RNA-基因测序分析发现，人CDC来源的外泌体富含miR-181b，可通过抑制蛋白激酶C δ的表达从而调控巨噬细胞极化，减少实验动物(大鼠、猪)梗死区域内CD68+巨噬细胞的浸润，发挥心脏保护作用。此外，Namazi等[29]发现，人CDC经缺氧预处理后所分泌的外泌体富含miR-210及miR-130a等具有促血管生成效应的miRNAs，可能通过抑制肝配蛋白A3及HoxA5的表达，增强人脐静脉内皮细胞成管能力从而促进新生血管形成。

2.3 诱导多能干细胞与胚胎干细胞源性外泌体miRNAs

目前关于诱导多能干细胞(iPS)与胚胎干细胞(ESC)的研究相对较少，可能与其潜在的致瘤、致畸性等安全隐患相关。Adamiak等[30]将iPS来源的外泌体与小鼠心肌内皮细胞共培养后发现，心肌内皮细胞迁移、存活及血管新生能力增强。在随后的体内实验中证实，通过心肌内注射的方式将外泌体注入小鼠心肌梗死区域后可有效改善其左心室重构及心功能，且效果优于iPS。进一步研究发现，与iPS比较，外泌体内特异性表达miR-145等33个miRNAs，可能通过调控Wnt、PI3K/Akt、丝裂原激活蛋白激酶、VEGF等通路从而发挥相应的心脏保护作用。Khan等[31]通过miRNA基因芯片分析发现，小鼠ESC来源的外泌体特异性表达59个miRNAs，其中miR-294可通过调控细胞周期进程从而提高H2O2氧化应激损伤下小鼠心脏祖细胞的存活率及增殖能力。

3 展望

目前关于干细胞源性外泌体通过miRNAs治疗心肌梗死的研究层出不穷，但大多只关注于miRNAs及其下游机制的探索，而致力于miRNAs上游调控的研究则相对较少。最近有关长链非编码RNA、环状RNA与miRNAs之间相互作用的研究已逐步开展，有望进一步阐明非编码RNA在心血管领域的作用机制。当前，外泌体的研究仍处于起步阶段，如何提高外泌体的分离纯度、准确地对其亚型进行分类[32]以及如何改善外泌体靶向性[33]等将是今后外泌体研究领域的重点。相信通过研究人员的不懈努力，外泌体可作为干细胞治疗的替代疗法早日应用于临床。